【摘要】：研究背景與目的盡管已有有效的疫苗,但是,乙型肝炎病毒(hepatitis B virus HBV)感染仍然是一個(gè)主要的健康問(wèn)題。全球大約有2.48億的乙肝病毒慢性感染者。乙肝病毒有兩種常見(jiàn)表型,30年前,HBeAg(HBV e antigen HBeAg)陽(yáng)性的野生型病毒株為主要的流行株,近幾年,HBeAg陰性HBV病毒株的感染呈上升趨勢(shì)。HBeAg陽(yáng)性和陰性兩種類型的慢性感染者在流行病學(xué)、發(fā)病機(jī)理、自然病程、預(yù)后及治療等方面都有很大的不同。HBeAg陰性患者對(duì)抗病毒治療相比HBeAg陽(yáng)性病人持續(xù)應(yīng)答率低,治療時(shí)間長(zhǎng),發(fā)展成肝癌的風(fēng)險(xiǎn)更大。因此,開(kāi)展HBeAg陰性HBV發(fā)病機(jī)制及其治療藥物的研究具有很重要的意義。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在疾病發(fā)病機(jī)理及藥物研發(fā)中具有重要作用。目前,很少有關(guān)于HBV HBeAg陰性模型的報(bào)道。因此,本實(shí)驗(yàn)旨在建立一個(gè)能模擬HBeAg陰性HBV持續(xù)感染的小鼠模型。方法1.分析53例HBV病人HBsAg及HBeAg的攜帶狀況,通過(guò)SNa Pshot進(jìn)行病毒基因型的鑒定。2.以臨床病人血清為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增HBeAg陰性HBV全長(zhǎng)基因,通過(guò)分子生物學(xué)方法將全長(zhǎng)基因克隆至pEASY-Blunt Simple載體,構(gòu)建pEASY-HBeAg-negative HBV質(zhì)粒,測(cè)序鑒定;測(cè)序結(jié)果在Gen Bank中進(jìn)行比對(duì)分析。3.用Bsp QI酶切pEASY-HBeAg-negative HBV質(zhì)粒,膠回收線狀目的片段,然后通過(guò)T4DNA連接酶過(guò)夜連接,使其在體外環(huán)化成共價(jià)閉合環(huán)狀的DNA(covalently closed circμlar cccDNA),對(duì)環(huán)化產(chǎn)物進(jìn)行Eco RI及PSAD酶切鑒定及測(cè)序鑒定。4.通過(guò)流體動(dòng)力學(xué)的方法將cccDNA及p AAV/HBV1.2質(zhì)粒通過(guò)尾靜脈分別注射到C57BL/6J小鼠中,注射后,分別于第1d、3d、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w、9w、10w通過(guò)小鼠尾靜脈采集血清樣本;于第3w和10w經(jīng)麻醉后頸椎脫臼處死,然后取肝組織。5.通過(guò)放射免疫法在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)病毒血清特異性標(biāo)志HBsAg和HBeAg的表達(dá);通過(guò)免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)肝臟組織中HBsAg及HBcAg的表達(dá);蘇木素-伊紅(HE)染色及酶聯(lián)免疫反應(yīng)觀察肝臟的病理變化及血清中轉(zhuǎn)氨酶的活性變化;利用熒光定量的方法檢測(cè)血清及肝臟中HBV DNA拷貝數(shù),并利用滾環(huán)擴(kuò)增聯(lián)合PCR的方法檢測(cè)肝臟中cccDNA的表達(dá)。結(jié)果1.53例HBV感染患者中,27名HBV陽(yáng)性的患者HBeAg檢測(cè)為陰性,占感染總?cè)藬?shù)的50.9%;HBV A基因型感染者1例,B基因型38例,C型感染者14例。2克隆基因與Gen Bank中JX661478.1號(hào)HBV基因序列可達(dá)98%的同源性;基因的4個(gè)開(kāi)放讀碼框完整,基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子區(qū)(BCP)存在A1762T,G1764A的雙突變,減少了HBeAg的表達(dá);前C區(qū)存在G1896A的突變,提前終止HBeAg的表達(dá)。3.測(cè)序及酶切驗(yàn)證都顯示,線性DNA被環(huán)化為cccDNA,沒(méi)有堿基的缺失及外源基因的插入。4.在注射HBeAg陰性cccDNA的小鼠中,注射5周內(nèi),HBV感染率達(dá)到100%;HBsAg水平迅速升高,并在第一周時(shí)達(dá)到峰值,隨后迅速下降;60%的cccDNA注射小鼠,HBsAg和HBcAg可持續(xù)表達(dá)超過(guò)10周;所有小鼠,HBeAg陰性;血清和肝臟中HBV DNA含量可分別達(dá)107拷貝/ml和108拷貝/ml;肝臟組織中可檢測(cè)到cccDNA的表達(dá)。p AAV-HBV 1.2質(zhì)粒小鼠,血清及肝臟中可檢測(cè)到HBsAg、HBeAg或HBsAg、HBcAg。結(jié)論首次在具有免疫活性的小鼠中成功建立了HBeAg陰性的HBV持續(xù)性感染的動(dòng)物模型。HBeAg陰性的模型小鼠與p AAV-HBV1.2模型小鼠相比,感染持續(xù)性、血清病毒學(xué)(HBeAg除外)和生物化學(xué)標(biāo)記物的水平?jīng)]有顯著性差異(P0.05)。該模型將為HBeAg陰性HBV感染的機(jī)理研究奠定基礎(chǔ),并將有助于新的抗病毒藥物的評(píng)價(jià)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R512.62;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2292335