發(fā)布時間：2018-10-22 09:28

【摘要】：研究背景 脊髓缺血再灌注損傷(Spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCIRI)一直是神經(jīng)科學(xué)研究的難點之一,SCIRI是指在某種損傷因素作用下脊髓經(jīng)過一定時間缺血后得到血液再灌注后出現(xiàn)明顯的功能障礙,甚至出現(xiàn)不可逆性脊髓神經(jīng)元遲發(fā)性死亡的現(xiàn)象。脊髓缺血再灌注的主要損傷因素在于再灌注后的繼發(fā)性損傷,決定了脊髓缺血再灌注損傷的預(yù)后。繼發(fā)損傷的發(fā)病機(jī)制主要涉及神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷以及凋亡等機(jī)制,因此保護(hù)脊髓神經(jīng)元,避免神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷以及凋亡,是治療脊髓缺血再灌注損傷的關(guān)鍵所在。 盡管臨床上已采用多種方法減輕脊髓缺血損傷,但是胸腹主動脈瘤手術(shù)患者不可避免發(fā)生脊髓缺血,有數(shù)據(jù)顯示3%～18%患者發(fā)生永久性損傷(急性截癱和/或延遲性截癱)。除此之外,脊髓腫瘤壓迫,脊柱畸形,椎管狹窄等患者圍手術(shù)期也會出現(xiàn)脊髓缺血/再灌注損傷。截癱造成患者失去工作能力并擔(dān)負(fù)巨額的醫(yī)療費用,給患者本人及家庭造成深痛的打擊和巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān),同時加重整個社會的醫(yī)療保險的負(fù)擔(dān)。 右美托咪定是一種新型的高選擇性α2腎上腺素受體激動劑,可產(chǎn)生劑量依賴性的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛和抗焦慮作用,因此被廣泛用于手術(shù)室和ICU患者。除此之外,右美托咪定的其他臨床作用也被廣受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定對卒中模型、創(chuàng)傷性脊髓損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。右美托咪定對心肌、肺、腎臟的保護(hù)作用亦有報道。 研究目的 觀察右美托咪定對兔脊髓缺血再灌注損傷后的后肢神經(jīng)功能、組織病理學(xué)、脊髓組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)表達(dá)的影響,探討右美托咪定預(yù)處理對脊髓缺血再灌注損傷的保護(hù)作用的可能機(jī)制,為臨床研究提供理論依據(jù)。 研究方法 脊髓缺血再灌注損傷的程度及其變化規(guī)律直接關(guān)系到脊髓繼發(fā)損傷程度及損傷機(jī)制,其中動物模型的選擇對研究結(jié)果的意義具有重要的影響。許多致脊髓缺血的因素仍未建立滿意的損傷模型,目前SCIRI模型繁多,常見包括腹主動脈阻斷法和腰動脈阻斷法建立的脊髓缺血再灌注模型,但尚無統(tǒng)一的分型和分級,而應(yīng)用單一SCIRI模型進(jìn)行研究,顯然不能滿足臨床治療的需要。目前,SCIRI的研究主要以腰段脊髓為研究對象,且傾向于選擇兔作為實驗研究對象。腰段脊髓的血液供應(yīng)主要來自腎下腹主動脈,兔腹主動脈及腰動脈動脈壁相對較厚,內(nèi)徑粗,游離時不易出血,腰動脈系腹主動脈的直接分支,常與靜脈伴行,且血管壓力高,血管壁薄,容易誤傷,一旦誤傷血管,因腹膜后間隙較小而止血困難,加之不同種屬兔子的腰動脈解剖差異較大,腰動脈多為3支以上,其腰動脈分支的數(shù)目、走行和直徑的明顯變異可能直接影響模型的穩(wěn)定性和研究結(jié)果。此外,由于腹膜后間隙較小,逐一尋找各腰動脈并將其全部結(jié)扎,尤其是結(jié)扎腎動脈上分支和髂總動脈下分支時,手術(shù)難度更大,延長了手術(shù)時間,這種高選性的完全結(jié)扎節(jié)段動脈的手術(shù)方法操作過程比較復(fù)雜,雖然不影響其他區(qū)域的血液供應(yīng),但造成脊髓永久性缺血損傷,且無再灌注過程,因此不符合 本研究目的。 鑒于以上原因,本研究在腎動脈分支下阻斷腹主動脈,采用改良的Zivin法制作脊髓缺血再灌注損傷模型,通過控制夾閉時間長短而引起脊髓組織不同程度損傷,手術(shù)簡便易行,損傷程度易于控制。具體操作步驟如下：腹部備皮,常規(guī)碘伏消毒,鋪無菌單。取腹正中切口,觸摸左側(cè)腎臟上極后,約劍突下2.5cm至恥骨聯(lián)合上5cm之間,逐層分離腹壁各層,進(jìn)入腹腔后將腸管推至右側(cè),并以溫生理鹽水紗墊覆蓋,確認(rèn)左腎動脈和腹主動脈后,自腹膜后間隙左腎動脈下鈍性分離顯露腹主動脈。于左腎動脈起始處下方0.5cm～1cm處,完全夾閉腹主動脈,監(jiān)測股動脈平均動脈壓降至OkPa (MAP=0mmHg),計時40mim后,開放腹主動脈。夾閉前5分鐘,經(jīng)耳緣靜脈注射肝素鈉150U/kg。術(shù)畢檢查腹腔無滲血后以慶大霉素8萬單位及甲硝唑10ml沖洗腹腔,逐層縫合腹部切口。 24只新西蘭兔隨機(jī)分為3組,每組8只,假手術(shù)組(S組),缺血再灌注組(I/R組),右美托咪定預(yù)處理組(DEX+I/R組)。假手術(shù)組不阻斷腹主動脈,僅實施麻醉及手術(shù)操作。缺血再灌注組阻斷腹主動脈40分鐘后開放灌注,右美托咪定預(yù)處理組靜脈持續(xù)泵注右美托咪定2.5μg/(kg·h)60min,然后完全夾閉腹主動脈,監(jiān)測股動脈平均動脈壓降至0kPa(MAP=0mmHg)后,夾閉腹主動脈4Omin開放。S組與I/R組用0.9%生理鹽水5m1/kg替代。再灌注4小時,12小時,24小時,48小時觀察動物后肢活動并進(jìn)行神經(jīng)功能評分。手術(shù)各組分別于再灌注后48小時后取實驗動物L(fēng)2-5脊髓節(jié)段行病理學(xué)檢查,采用HE染色觀察脊髓標(biāo)本的一般病理學(xué)改變,TUNEL法染色觀察脊髓標(biāo)本的細(xì)胞凋亡情況,分別使用Western-blot、免疫組化染色法檢測脊髓組織中Bc1-2、Bax、Caspase-3蛋白的表達(dá)。Elisa法檢測丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性。研究結(jié)果 所有實驗動物在試驗周期內(nèi)(2天)均存活,動物存活率100%。5例術(shù)后出現(xiàn)尿儲留,經(jīng)保守治療(膀胱按摩)后好轉(zhuǎn)。實驗過程中,各組動物呼吸、心率、血壓、體溫等生命體征平穩(wěn)。術(shù)后腹部切口對良好,無紅腫以及膿性分泌物。 1.本實驗使用Tarlov評分系統(tǒng)評估后肢神經(jīng)功能。I/R組,DEX+I/R組在再灌注后均有不同程度的下肢癱瘓。DEX+I/R組于再灌注后各觀察時間點后肢神經(jīng)功能評分(改良Tarlov評分)均高于I/R組(P0.05)。 2.S組,I/R組和DEX+I/R組于再灌注后48h脊髓組織切片HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)：s組：顯示神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常。正常運動神經(jīng)元數(shù)目較多,輪廓清楚,神經(jīng)細(xì)胞周圍無散在的空泡形成；細(xì)胞成多角形；胞漿均勻紅染,內(nèi)有尼氏體呈顆粒狀均勻分布；細(xì)胞核成圓形,核仁明顯。I/R組：顯示神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清。正常運動神經(jīng)元數(shù)目極少。神經(jīng)細(xì)胞固縮；尼氏體淡染,胞漿中出現(xiàn)空泡狀改變；核萎縮,核仁消失；組織中血管及實質(zhì)可見散在的大小不等的出血灶。DEX+IR組：顯示神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,有輕度的水腫；正常細(xì)胞仍較I/R組多;部分神經(jīng)細(xì)胞也發(fā)生了胞質(zhì)和核質(zhì)模糊性改變,空泡較I/R組少,未見明顯出血灶。DEX+I/R組(右美托咪定預(yù)處理組)脊髓前角正常運動神經(jīng)元的百分率較I/R組(缺血再灌注組)明顯增加,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.s組,I/R組和DEX+I/R組于再灌注后48h脊髓組織切片TUNEL染色,光學(xué)顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)：s組：顯示神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)正常,脊髓前角運動神經(jīng)元中見少量TUNEL染色；I/R組：顯示脊髓前角內(nèi)有大量空泡形成,內(nèi)可見TUNEL陽性的棕色運動神經(jīng)元核數(shù)目較多。DEX+I/R組：顯示脊髓前角內(nèi)空泡和TUNEL陽性的凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目較1/R組均明顯減少。計算再灌注后48h的脊髓前角正常運動神經(jīng)元及TUNEL陽性的凋亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)目,按照(TUNEL陽性神經(jīng)元數(shù)/神經(jīng)元總數(shù))×100%計算脊髓神經(jīng)元的凋亡指數(shù)：S組(假手術(shù)組)可見極少量TUNEL陽性染色細(xì)胞。I/R組TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)目顯著增多。DEX+I/R組(右美托咪定預(yù)處理組)TUNEL陽性染色細(xì)胞數(shù)目較I/R組(缺血再灌注組)顯著減少,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.Western-blot和免疫組化染色檢測脊髓組織中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn),與S組相比較,I/R組Bax蛋白表達(dá)顯著增加；DEX+I/R組(右美托咪定預(yù)處理組)Bax蛋白表達(dá)較I/R組顯著減少。DEX+I/R組(右美托咪定預(yù)處理組)Bcl-2蛋白表達(dá)較I/R組和s組均顯著增加。DEX+I/R組(右美托咪定預(yù)處理組)Caspase-3蛋白表達(dá)較I/R組顯著減少。 5.Elisa法檢測發(fā)現(xiàn),I/R組與DEX+I/R組比較,脊髓缺血再灌注后脊髓組織SOD活性均較低(P0.05),而MDA含量均增多(P0.05)。研究結(jié)論 1.通過形態(tài)學(xué)證實右美托咪定確實能有效對脊髓缺血再灌注損傷后的脊髓神經(jīng)細(xì)胞起一定的保護(hù)作用。 2.在脊髓缺血再灌注損傷中,右美托咪定通過促進(jìn)Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)、抑制Bax、Caspase-3蛋白表達(dá),從而減少神經(jīng)細(xì)胞調(diào)亡,對脊髓缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。 3.右美托咪定對脊髓缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用可能與其抑制脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R614

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2286771