【摘要】：目的：肌萎縮側(cè)索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一種病因未明神經(jīng)系統(tǒng)變性病，選擇性損傷大腦皮層運動神經(jīng)元、腦干運動神經(jīng)核神經(jīng)元、脊髓前角a運動神經(jīng)元，導(dǎo)致進行性加重的肌肉無力、萎縮，最終因呼吸肌麻痹死亡。有許多流行病學(xué)的危險因素，例如暴露于重金屬、電或機械損傷、劇烈的體育活動都會影響到肌萎縮側(cè)索硬化（ALS）的發(fā)病。但是還有兩個廣為接受的危險因素：年齡和性別。研究表明男性發(fā)病率高于女性，49歲以前男女發(fā)病率之比為3.98:1，55歲以后男女發(fā)病率之比為1.63:1；且男性發(fā)病早于女性[1]；家族性ALS動物模型SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠的發(fā)病時間雄性早于雌性，生存時間雌性大于雄性[2]，說明性別可能是其ALS發(fā)病的危險因素，性激素可能對ALS發(fā)病過程中神經(jīng)元的變性、丟失發(fā)揮作用。 另有研究發(fā)現(xiàn)ALS患者男性以肢體發(fā)病為主，女性以球部發(fā)病為主[1]�？夏岬喜∈且环NX-連鎖的雄激素受體基因突變引起的運動神經(jīng)元病，主要影響高位頸髓及延髓的下運動神經(jīng)元，以上肢發(fā)病常見[3]。家族性肌萎縮側(cè)索硬化動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）的特征性臨床表現(xiàn)為成年（12周左右）發(fā)病，后肢運動功能障礙并逐漸進展至終末期（17-20周）[4]。目前有關(guān)雄激素受體（AR）在ALS小鼠脊髓表達(dá)情況的報道少見。 本實驗應(yīng)用免疫熒光的方法，觀察家族型肌萎縮側(cè)索硬化動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）病程腰段脊髓前角細(xì)胞雄激素受體的表達(dá)與分布情況,應(yīng)用免疫組化的方法計數(shù)家族型肌萎縮側(cè)索硬化動物模型（SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠）病程腰段脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)目及觀察運動神經(jīng)元雄激素受體的表達(dá)情況,旨在探討ALS的發(fā)病過程中雄激素受體的作用，為ALS發(fā)病機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。 方法： 1模型建立及分組 B6SJL-BTg（SOD1G93A）1Gur/J半合子雄鼠與B6SJLF1/J+/+雌鼠1:1雜交，在恒溫、恒濕、12h光照/黑暗交替循環(huán)、無特殊病原菌的（Specificpathogen free， SPF）環(huán)境中，喂以滅菌的SPF級顆粒型鼠類飼料及滅菌水，經(jīng)剪尾尖提取DNA、PCR擴增后、瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果示（Fig.1）：位于200-300bp之間的條帶（236bp）為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。沒有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠。 參考Vercelli A[5]等的1-5分評分法進行評分,4分為發(fā)病時間，1分為死亡時間,60天為癥狀前期，4分為癥狀早期，1分為終末期。各對照組為同窩、同月齡未轉(zhuǎn)人突變的SOD1基因的小鼠。每組雌雄各3只小鼠。 2取材 10%水合氯醛350mg/kg腹腔注射麻醉后，心臟灌注4%多聚甲醛固定20min，取小鼠腰段脊髓，以4%多聚甲醛固定48h。 3免疫熒光 后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用免疫熒光三標(biāo)染色的方法在激光共聚焦顯微鏡下觀察雄激素受體在SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓前角中的細(xì)胞定位。 4免疫組化染色 后固定的組織塊震蕩切片25μm厚，應(yīng)用ABC方法進行SMI-32及AR免疫組化染色，計數(shù)脊髓前角運動神經(jīng)元數(shù)量及觀察運動神經(jīng)元AR受體表達(dá)。脊髓前角α運動神經(jīng)元數(shù)量的計數(shù)方法：對連續(xù)切片的每第五張切片的雙側(cè)脊髓前角的α運動神經(jīng)元計數(shù)，每段腰髓觀察10個切片。被計數(shù)的α運動神經(jīng)元標(biāo)準(zhǔn)為：位于前角、直徑＞25μm，細(xì)胞核清楚[6]。 5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。采用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示腰膨大脊髓切片兩側(cè)神經(jīng)元計數(shù)之和，三組數(shù)據(jù)的比較采用單因素方差分析，兩組數(shù)據(jù)的比較采用兩個獨立樣本比較的t檢驗，以a=0.05為顯著性檢驗標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)果： 1模型建立 如Fig.1所示：位于200-300bp之間的條帶（236bp）為mSOD1的PCR產(chǎn)物，此種小鼠為SOD1G93A轉(zhuǎn)基因陽性小鼠。沒有此條帶為非mSOD1的PCR產(chǎn)物，為非SOD1G93A轉(zhuǎn)基因鼠。 2免疫熒光 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角運動神經(jīng)元有雄激素受體表達(dá)，且位于胞漿，而星型膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞均無雄激素受體表達(dá)；對照組與ALS小鼠一致（Fig.2）。 3免疫組化染色(SMI-32) SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.672.92、14.732.84、8.472.72，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.3，Table1）。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.603.20、17.473.40、8.473.44，各組比較P值分別為0.015、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.4，Table2）。雄雌對比，P值分別為0.953、0.024、1.000，僅發(fā)病期差別有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.5，Table3）。 4免疫組化染色(AR) 4.1與免疫熒光結(jié)果一致，SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠AR表達(dá)于脊髓前角運動神經(jīng)元，且位于胞漿，胞漿著色均勻一致，隨病情進展，未出現(xiàn)顆粒樣沉積。對照組與ALS小鼠一致（Fig.6）。 4.2SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.871.81、14.931.67、8.671.23，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.7，Table4）。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠在癥狀前期、發(fā)病期、終末期神經(jīng)元計數(shù)分別為20.801.97、17.672.13、8.671.59，各組比較P值分別為0.000、0.000、0.000，差別均有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.8，Table5）。雄雌對比，P值分別為0.924、0.001、1.000，僅發(fā)病期差別有統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.9，Table6）。5免疫組化(SMI-32)和免疫組化(AR)的比較 SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雄性小鼠各期SMI-32免疫陽性的神經(jīng)元計數(shù)與AR免疫陽性的神經(jīng)元計數(shù)相比，P值分別0.823、0.816、0.798，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.10，Table7）。SOD1G93A轉(zhuǎn)基因雌性小鼠P值分別為0.839、0.848、0.840，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（Fig.11，Table8）。 結(jié)論： 1.正常小鼠腰段脊髓前角細(xì)胞：雄激素受體（AR）在運動神經(jīng)元表達(dá)，且位于胞漿，星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞均無表達(dá)。 2.SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓前角細(xì)胞：雄激素受體（AR）在運動神經(jīng)元表達(dá)，且位于胞漿，星型膠質(zhì)細(xì)胞及小膠質(zhì)細(xì)胞均無異常表達(dá)。 3.SOD1G93A轉(zhuǎn)基因小鼠腰段脊髓前角雄激素受體（AR)逐漸減少,與病程進展中運動神經(jīng)元數(shù)目減少有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R744

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本文編號：2285809