【摘要】：【研究目的】褪黑素(melatonin)是哺乳動(dòng)物松果體分泌的一種激素,分泌量與晝夜節(jié)律密切相關(guān)。褪黑素分布在血液中,游離至各個(gè)部位,通過(guò)其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)的兩個(gè)主要受體MT1和MT2發(fā)揮作用。褪黑素具有維持晝夜節(jié)律、促進(jìn)睡眠的生理作用。近年來(lái),陸續(xù)發(fā)現(xiàn)褪黑素還有其它重要功能,包括神經(jīng)保護(hù)和自由基清除等。褪黑素對(duì)許多神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥、帕金森病、亨廷頓癥、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、以及自閉癥等廣泛發(fā)育障礙的疾病癥狀有改善作用。學(xué)習(xí)與記憶能力是人腦的高級(jí)功能,大腦內(nèi)的許多部位都與學(xué)習(xí)記憶功能相關(guān),其中研究最多的是海馬及其鄰近結(jié)構(gòu)、大腦皮層、杏仁核、丘腦等。突觸可塑性是動(dòng)物學(xué)習(xí)與記憶的生物學(xué)基礎(chǔ),包括結(jié)構(gòu)和功能的可塑性。在功能可塑性中,長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)(LTP)和長(zhǎng)時(shí)程抑制(LTD)是哺乳動(dòng)物大腦中主要的長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性形式。除了神經(jīng)元之間的信號(hào)傳輸外,膠質(zhì)細(xì)胞的修飾和神經(jīng)生化物質(zhì)如神經(jīng)類固醇、神經(jīng)肽等都能影響到突觸可塑性。近年來(lái),有關(guān)長(zhǎng)時(shí)程抑制的研究獲得了重大進(jìn)展,特別是其分子機(jī)制的研究和在學(xué)習(xí)與記憶過(guò)程中以及在神經(jīng)系統(tǒng)認(rèn)知疾病方面的作用受到廣泛關(guān)注。長(zhǎng)時(shí)程抑制的分子機(jī)制主要有兩個(gè),N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體依賴的LTD和代謝型谷氨酸受體(m Glu R)依賴的LTD,通過(guò)不同的通路,都引起α-氨基-3-羧基-5-甲基VA唑-4-丙酸(AMPA)受體從神經(jīng)元細(xì)胞膜向細(xì)胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),突觸后膜興奮性降低,最終引起LTD。LTD過(guò)度增強(qiáng)引起的代表性認(rèn)知障礙疾病是脆性X綜合征,也是一種臨床上最常見(jiàn)的遺傳性智力低下癥。FXS模型小鼠突觸可塑性異常,主要表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上樹(shù)突發(fā)育障礙和功能上突觸傳遞紊亂;電生理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其海馬體和前扣帶回皮層區(qū)域長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)明顯減弱而長(zhǎng)時(shí)程抑制顯著增強(qiáng);行為學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其額葉皮層參與的恐懼記憶能力顯著降低。褪黑素在學(xué)習(xí)與記憶功能方面的作用和機(jī)制還不明確,已有的報(bào)道顯示褪黑素能夠抑制海馬體不同區(qū)域的LTP,且這種抑制是通過(guò)激動(dòng)其受體MT2介導(dǎo)的,但褪黑素是否會(huì)影響LTD還未見(jiàn)報(bào)道。本研究擬以分子生物學(xué)和電生理學(xué)手段觀察褪黑素對(duì)神經(jīng)元興奮性傳遞的影響,闡明其對(duì)LTD的影響和作用機(jī)制,進(jìn)而探討其在FXS中的作用,從而為發(fā)掘潛在的藥物靶點(diǎn)和臨床治療策略提供新的思路以及理論依據(jù)�！狙芯糠椒ā�1.體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元,使用褪黑素受體MT2激動(dòng)劑處理神經(jīng)元,采用免疫印跡技術(shù)觀察其對(duì)神經(jīng)元中AMPA受體Glu A1和Glu A2亞基磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用。2.采用生物素標(biāo)記的方法檢測(cè)MT2拮抗劑和激動(dòng)劑對(duì)體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元AMPA受體Glu A1和Glu A2亞基膜上表達(dá)水平的調(diào)節(jié)作用。3.利用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)觀察褪黑素對(duì)體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元s EPSC和m EPSC幅度和發(fā)放頻率的影響;急性分離獲得含海馬的大鼠腦薄切片,記錄褪黑素對(duì)CA1區(qū)神經(jīng)元evoked EPSC的影響。4.利用活體在體記錄技術(shù)觀察腹腔注射褪黑素對(duì)大鼠CA1區(qū)f EPSP的影響。5.使用NMDAR拮抗劑和m Glu R拮抗劑預(yù)處理腦片,再給予褪黑素觀察evoked EPSC的變化;在給予褪黑素evoked EPSC達(dá)穩(wěn)定后,分別使用NMDAR或m Glu R所依賴的電刺激刺激腦片,觀察LTD的變化,探尋褪黑素的作用機(jī)制。6.麻醉大鼠腹腔注射MT2拮抗劑和m Glu R拮抗劑,再給予褪黑素觀察f EPSP的變化,探尋褪黑素的作用機(jī)制。7.采用免疫印跡技術(shù),比較Fmr1 KO小鼠與WT小鼠海馬及ACC區(qū)域褪黑素受體的表達(dá)水平,觀察其是否有過(guò)表達(dá)現(xiàn)象。8.通過(guò)定位注射sh RNA,降低Fmr1 KO小鼠中過(guò)量表達(dá)的褪黑素受體,14天后建立恐懼記憶模型,觀察其學(xué)習(xí)記憶能力的變化�！狙芯拷Y(jié)果】1.激動(dòng)MT2能降低神經(jīng)元AMPA受體Glu A1 Ser831位點(diǎn)磷酸化水平,且升高Glu A2 Ser880位點(diǎn)磷酸化水平。2.激動(dòng)MT2能引起AMPA受體Glu A1和Gl A2亞型在細(xì)胞膜上的表達(dá)減少,促進(jìn)其AMPA受體從胞膜向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),而使用MT2選擇性抑制劑預(yù)處理能抑制這種轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象。3.褪黑素能顯著降低海馬神經(jīng)元s EPSC和m EPSC的幅度和發(fā)放頻率,即降低神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞;在腦片中灌流褪黑素會(huì)顯著降低大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元evoked EPSC的幅度,引起LTD。4.腹腔注射褪黑素顯著減小麻醉大鼠CA1區(qū)f EPSP的斜率,引起LTD。5.褪黑素在海馬CA1區(qū)引起的LTD不受NMDAR拮抗劑的影響,而完全被m Glu R拮抗劑所抑制;當(dāng)褪黑素誘導(dǎo)LTD達(dá)穩(wěn)定后,使用NMDAR依賴的LFS刺激腦片能進(jìn)一步誘導(dǎo)LTD,而使用m Glu R依賴的pp LFS刺激腦片不會(huì)對(duì)之前的LTD產(chǎn)生影響。6.提前給予MT2或m Glu R拮抗劑能完全抑制褪黑素在麻醉大鼠海馬CA1區(qū)引起的LTD。7.在Fmr1 KO小鼠與WT小鼠海馬區(qū)褪黑素受體表達(dá)水平無(wú)顯著差異,但在Fmr1KO小鼠ACC區(qū)MT2過(guò)度表達(dá)。8.下調(diào)Fmr1 KO小鼠ACC區(qū)MT2的表達(dá)能顯著改善Fmr1 KO小鼠的恐懼記憶能力�！狙芯拷Y(jié)論】1.褪黑素通過(guò)激動(dòng)MT2在神經(jīng)元中能引起AMPA受體從包膜向胞漿內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),誘導(dǎo)產(chǎn)生LTD。2.褪黑素誘導(dǎo)LTD機(jī)制與Group I m Glu R-LTD機(jī)制相同。3.Fmr1 KO小鼠ACC區(qū)MT2過(guò)度表達(dá),下調(diào)MT2的過(guò)度表達(dá)可部分糾正模型動(dòng)物的行為學(xué)表征。
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【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R338.6
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本文編號(hào)：2274158