【摘要】：【研究目的】褪黑素(melatonin)是哺乳動物松果體分泌的一種激素,分泌量與晝夜節(jié)律密切相關。褪黑素分布在血液中,游離至各個部位,通過其在哺乳動物體內(nèi)的兩個主要受體MT1和MT2發(fā)揮作用。褪黑素具有維持晝夜節(jié)律、促進睡眠的生理作用。近年來,陸續(xù)發(fā)現(xiàn)褪黑素還有其它重要功能,包括神經(jīng)保護和自由基清除等。褪黑素對許多神經(jīng)退行性疾病如阿爾茨海默癥、帕金森病、亨廷頓癥、肌萎縮性側索硬化癥、以及自閉癥等廣泛發(fā)育障礙的疾病癥狀有改善作用。學習與記憶能力是人腦的高級功能,大腦內(nèi)的許多部位都與學習記憶功能相關,其中研究最多的是海馬及其鄰近結構、大腦皮層、杏仁核、丘腦等。突觸可塑性是動物學習與記憶的生物學基礎,包括結構和功能的可塑性。在功能可塑性中,長時程增強(LTP)和長時程抑制(LTD)是哺乳動物大腦中主要的長時程突觸可塑性形式。除了神經(jīng)元之間的信號傳輸外,膠質細胞的修飾和神經(jīng)生化物質如神經(jīng)類固醇、神經(jīng)肽等都能影響到突觸可塑性。近年來,有關長時程抑制的研究獲得了重大進展,特別是其分子機制的研究和在學習與記憶過程中以及在神經(jīng)系統(tǒng)認知疾病方面的作用受到廣泛關注。長時程抑制的分子機制主要有兩個,N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體依賴的LTD和代謝型谷氨酸受體(m Glu R)依賴的LTD,通過不同的通路,都引起α-氨基-3-羧基-5-甲基VA唑-4-丙酸(AMPA)受體從神經(jīng)元細胞膜向細胞漿內(nèi)轉運,突觸后膜興奮性降低,最終引起LTD。LTD過度增強引起的代表性認知障礙疾病是脆性X綜合征,也是一種臨床上最常見的遺傳性智力低下癥。FXS模型小鼠突觸可塑性異常,主要表現(xiàn)為結構上樹突發(fā)育障礙和功能上突觸傳遞紊亂;電生理學研究發(fā)現(xiàn)其海馬體和前扣帶回皮層區(qū)域長時程增強明顯減弱而長時程抑制顯著增強;行為學研究發(fā)現(xiàn)其額葉皮層參與的恐懼記憶能力顯著降低。褪黑素在學習與記憶功能方面的作用和機制還不明確,已有的報道顯示褪黑素能夠抑制海馬體不同區(qū)域的LTP,且這種抑制是通過激動其受體MT2介導的,但褪黑素是否會影響LTD還未見報道。本研究擬以分子生物學和電生理學手段觀察褪黑素對神經(jīng)元興奮性傳遞的影響,闡明其對LTD的影響和作用機制,進而探討其在FXS中的作用,從而為發(fā)掘潛在的藥物靶點和臨床治療策略提供新的思路以及理論依據(jù)�！狙芯糠椒ā�1.體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元,使用褪黑素受體MT2激動劑處理神經(jīng)元,采用免疫印跡技術觀察其對神經(jīng)元中AMPA受體Glu A1和Glu A2亞基磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用。2.采用生物素標記的方法檢測MT2拮抗劑和激動劑對體外培養(yǎng)大鼠皮層神經(jīng)元AMPA受體Glu A1和Glu A2亞基膜上表達水平的調(diào)節(jié)作用。3.利用全細胞膜片鉗技術觀察褪黑素對體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元s EPSC和m EPSC幅度和發(fā)放頻率的影響;急性分離獲得含海馬的大鼠腦薄切片,記錄褪黑素對CA1區(qū)神經(jīng)元evoked EPSC的影響。4.利用活體在體記錄技術觀察腹腔注射褪黑素對大鼠CA1區(qū)f EPSP的影響。5.使用NMDAR拮抗劑和m Glu R拮抗劑預處理腦片,再給予褪黑素觀察evoked EPSC的變化;在給予褪黑素evoked EPSC達穩(wěn)定后,分別使用NMDAR或m Glu R所依賴的電刺激刺激腦片,觀察LTD的變化,探尋褪黑素的作用機制。6.麻醉大鼠腹腔注射MT2拮抗劑和m Glu R拮抗劑,再給予褪黑素觀察f EPSP的變化,探尋褪黑素的作用機制。7.采用免疫印跡技術,比較Fmr1 KO小鼠與WT小鼠海馬及ACC區(qū)域褪黑素受體的表達水平,觀察其是否有過表達現(xiàn)象。8.通過定位注射sh RNA,降低Fmr1 KO小鼠中過量表達的褪黑素受體,14天后建立恐懼記憶模型,觀察其學習記憶能力的變化�！狙芯拷Y果】1.激動MT2能降低神經(jīng)元AMPA受體Glu A1 Ser831位點磷酸化水平,且升高Glu A2 Ser880位點磷酸化水平。2.激動MT2能引起AMPA受體Glu A1和Gl A2亞型在細胞膜上的表達減少,促進其AMPA受體從胞膜向胞漿內(nèi)轉運,而使用MT2選擇性抑制劑預處理能抑制這種轉運現(xiàn)象。3.褪黑素能顯著降低海馬神經(jīng)元s EPSC和m EPSC的幅度和發(fā)放頻率,即降低神經(jīng)元的興奮性突觸傳遞;在腦片中灌流褪黑素會顯著降低大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元evoked EPSC的幅度,引起LTD。4.腹腔注射褪黑素顯著減小麻醉大鼠CA1區(qū)f EPSP的斜率,引起LTD。5.褪黑素在海馬CA1區(qū)引起的LTD不受NMDAR拮抗劑的影響,而完全被m Glu R拮抗劑所抑制;當褪黑素誘導LTD達穩(wěn)定后,使用NMDAR依賴的LFS刺激腦片能進一步誘導LTD,而使用m Glu R依賴的pp LFS刺激腦片不會對之前的LTD產(chǎn)生影響。6.提前給予MT2或m Glu R拮抗劑能完全抑制褪黑素在麻醉大鼠海馬CA1區(qū)引起的LTD。7.在Fmr1 KO小鼠與WT小鼠海馬區(qū)褪黑素受體表達水平無顯著差異,但在Fmr1KO小鼠ACC區(qū)MT2過度表達。8.下調(diào)Fmr1 KO小鼠ACC區(qū)MT2的表達能顯著改善Fmr1 KO小鼠的恐懼記憶能力�！狙芯拷Y論】1.褪黑素通過激動MT2在神經(jīng)元中能引起AMPA受體從包膜向胞漿內(nèi)轉運,誘導產(chǎn)生LTD。2.褪黑素誘導LTD機制與Group I m Glu R-LTD機制相同。3.Fmr1 KO小鼠ACC區(qū)MT2過度表達,下調(diào)MT2的過度表達可部分糾正模型動物的行為學表征。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R338.6
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本文編號：2274158