【摘要】：在我國,肝病發(fā)病率較高,各類肝炎、肝硬化、肝癌、先天性與代謝性肝病等,一般的藥物治療和外科手術(shù)治療難以達(dá)到滿意的效果。因此,對(duì)肝臟移植手術(shù)有很大的需求。由于肝臟功能復(fù)雜、手術(shù)難度大、術(shù)后管理困難等因素,但肝臟在移植過程中往往會(huì)遭受不同程度的各種損傷,從而導(dǎo)致供肝術(shù)后肝功能不全、原發(fā)性移植肝無功能(Primary graft non-function, PNF)和移植物功能延遲恢復(fù)(delayed graft function, DGF)等。移植后肝功能不良和供肝保存欠佳、缺血再灌損傷(Ischemia-reperfusion, I/R)關(guān)系極為密切。研究表明,肝臟缺血再灌注損傷是導(dǎo)致早期移植后肝功能不全的最常見原因之一,同時(shí)也是影響肝移植手術(shù)后移植物長(zhǎng)期存活的重要因素。我國又是世界上終末期肝病發(fā)病率最高的地區(qū)之一,肝病患者眾多,肝臟供需矛盾突出。因此,尋找一種安全有效的移植肝保存法,探究肝移植缺血再灌損傷機(jī)制已成為重要的研究課題。肝移植缺血再灌注損傷及相應(yīng)炎癥反應(yīng)常導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷及壞死,如何避免肝細(xì)胞缺血再灌注損傷對(duì)疾病的治療及預(yù)后有著重要的價(jià)值。 缺血預(yù)適應(yīng)(Ischemic preconditioning, IPC),也叫缺血預(yù)適應(yīng),是一種通過預(yù)先短暫缺血以耐受隨后較長(zhǎng)時(shí)間的缺血損傷,并減輕組織后續(xù)缺血再灌注損傷的現(xiàn)象。1986年Murry等首次提出了缺血預(yù)處理這一概念。Laskey和Szmagala的臨床研究指出,缺血預(yù)適應(yīng)可預(yù)防經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)(Percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)和心臟手術(shù)所致的心肌缺血損傷。Toosy等首次研究發(fā)現(xiàn)了腎臟IPC對(duì)腎組織學(xué)損傷也具有保護(hù)作用。研究表明缺血預(yù)適應(yīng)現(xiàn)象在其它許多器官都存在,如腦、肝、小腸、骨骼肌、腎和肺等,而且各組織器官之間存在交叉缺血耐受現(xiàn)象,例如骨骼肌、腎臟的短暫性缺血可有效減輕冠狀血管阻塞所致的心肌梗死灶的容積。缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠字體肝移植缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制還不明確,是與臨床肝移植手術(shù)減少肝組織損傷密切相關(guān)的課題。 白介素-6(Interleukin-6,IL-6)是細(xì)胞因子的核心成員之一,是廣泛表達(dá)于活化的B細(xì)胞、靜止的T細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞、肝細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、髓樣白血病細(xì)胞等細(xì)胞表面的一種具有多種生物學(xué)活性的刺激因子。IL-6主要由單核巨噬細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生,人類IL-6是由213個(gè)氨基酸組成的,可由腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,T]NF)誘導(dǎo)產(chǎn)生并可增加TNF的有害作用,它具有誘導(dǎo)T、B淋巴細(xì)胞分化、刺激肝細(xì)胞合成急性期反應(yīng)蛋白、催化和放大炎性反應(yīng)和毒性等作用,對(duì)組織和細(xì)胞產(chǎn)生損害。IL-6作為一種多效性細(xì)胞因子,是參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)的重要因子之一,是機(jī)體對(duì)感染和組織損傷所引起應(yīng)答反應(yīng)的主要介質(zhì),能夠和集落刺激因子(Colony-stimulating factor, CSF)協(xié)同作用,促進(jìn)骨髓源細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的裂解功能。病毒、細(xì)菌感染均能誘導(dǎo)體內(nèi)IL-6表達(dá)增加,在多種自身免疫疾病和腫瘤疾病中也表達(dá)異常。作為機(jī)體的保護(hù)機(jī)制,血清中IL-6水平升高對(duì)機(jī)體清除感染的病毒起到重要作用,此外,研究指出IL-6的表達(dá)水平與感染的嚴(yán)重程度、炎癥反應(yīng)的程度呈正相關(guān),可作為判斷病情嚴(yán)重程度的靈敏指標(biāo)。 本研究首先構(gòu)建大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷模型,對(duì)缺血預(yù)適應(yīng)組和對(duì)照組大鼠肝組織受損情況進(jìn)行病理分析,然后對(duì)相關(guān)指標(biāo)血漿谷草轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的含量、IL-6的表達(dá)、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase, SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量進(jìn)行檢測(cè),分析血漿中IL-6、TNF-α和IL-1p的表達(dá)在缺血預(yù)適應(yīng)組與對(duì)照組的差異,以及與肝組織損傷程度的相關(guān)性和可能的作用機(jī)制。本文旨在對(duì)肝移植缺血再灌注損傷的機(jī)制和保護(hù)性預(yù)適應(yīng)進(jìn)行研究,為肝移植缺血再灌注損傷的臨床治療和保護(hù)提供新的依據(jù)。 方法 首先建立大鼠門靜脈灌注的自體肝移植缺血再灌注模型,健康、成年、雄性SPF級(jí)純系SD大鼠72只,體重約280-300g,由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠常規(guī)飼養(yǎng),術(shù)前禁食12h,不禁水。將72只SD大鼠隨機(jī)分為3組：正常大鼠對(duì)照組(A組)、大鼠肝移植組(B組)和缺血預(yù)適應(yīng)大鼠肝移植組(C組)。B組大鼠直接行肝移植術(shù)。C組大鼠術(shù)前行肝臟缺血預(yù)適應(yīng),即夾閉肝門部肝動(dòng)脈及門靜脈15min,后回復(fù)肝臟供血,20min后行大鼠自體肝移植。 采用乙醚棉球?qū)?zhǔn)大鼠口鼻行開放式吸入麻醉。常規(guī)備皮、消毒后,取腹正中切口入腹。進(jìn)腹后先用棉簽將整個(gè)腸道翻出腹腔外以利于術(shù)野暴露。然后用組織剪游離肝鐮狀韌帶后切斷,向右翻動(dòng)肝左葉和中葉,暴露肝食管韌帶,結(jié)扎、切斷肝食管韌帶內(nèi)血管,并以此為起點(diǎn)逆時(shí)針游離肝臟。首先沿食管向上分離,切斷左三角韌帶,縫扎、切斷左膈血管。然后向左翻轉(zhuǎn)肝臟,切斷右三角韌帶。再繼續(xù)向上游離肝上下腔靜脈(Suprahepatic vena cava,SVC)至膈靜脈裂孔,然后向下游離腔靜脈至右腎靜脈水平,期間結(jié)扎、切斷腰靜脈。游離肝腎韌帶,結(jié)扎切斷右腎上腺靜脈。肝臟復(fù)位,游離肝下下腔靜脈(Infrahepatic vena cava,IVC),將其分離至左腎靜脈水平以上。打開肝十二指腸韌帶,找出肝動(dòng)脈(Hepatic artery,HA),將其分離并于動(dòng)脈后方過線以備阻斷。繼續(xù)從腸系膜下靜脈和脾靜脈匯合處游離門靜脈(Portal vein,PV)至肝門部,期間需結(jié)扎幽門靜脈。最后鈍性分離肝胃韌帶,將肝兩片葉游離出來。至此肝臟全部游離完畢。將稀釋后的肝素注射液(35U/L)3mL通過穿刺針灌入門靜脈,使其完全肝素化。在髂總動(dòng)脈與左腎動(dòng)脈之間向近心端穿刺腹主動(dòng)脈,用血管夾固定穿刺針,在腹腔干以上和穿刺點(diǎn)以下上血管夾阻斷。同時(shí)在SVC、IVC右腎靜脈水平上血管夾,并在IVC血管夾稍上方縱行剪開約1mm靜脈壁作為流出道。然后以2.5mL/min速度通過輸液泵同時(shí)經(jīng)PV、腹主動(dòng)脈穿刺處灌注4℃含肝素(12.5U/mL)的乳酸林格氏液20mL,在此同時(shí)不斷用4℃乳酸林格氏液澆注肝臟表面迅速降溫。當(dāng)肝臟顏色變?yōu)榫鶆蛲咙S色時(shí),灌注結(jié)束。灌注完成后拔出穿刺針,修補(bǔ)PV和腹主動(dòng)脈穿刺點(diǎn),用8-0prolene縫線修補(bǔ)IVC流出道,在肝動(dòng)脈預(yù)留線處阻斷肝動(dòng)脈并上血管夾,然后松開PV、SVC、IVC、腹主動(dòng)脈的血管夾,恢復(fù)肝臟血供,結(jié)束無肝期。并同時(shí)用38℃生理鹽水澆注肝臟表面,快速復(fù)溫。肝動(dòng)脈開放后,觀察腹腔內(nèi)無出血點(diǎn),連續(xù)縫合關(guān)腹。術(shù)后對(duì)大鼠進(jìn)行燈照復(fù)溫,直至麻醉清醒可以站立。 各組大鼠再灌注2h、6h、12h和24h后,將大鼠麻醉,從下腔靜脈采血5ml,離心后吸取血清,-80℃冰箱保存,用于ALT.AST檢測(cè)。切取被阻斷的肝組織,林格氏液洗凈血液,修成小塊(厚度不超過0.5cm),一部分用10%中性甲醛固定,一部分保存于-80℃冰箱。 術(shù)后使用肝臟石蠟切片進(jìn)行HE染色和電子顯微鏡觀察大鼠肝臟組織的病理學(xué)改變和肝細(xì)胞中線粒體顯微結(jié)構(gòu)的變化。在各組大鼠缺血再灌注后2h、6h、12h、24h后,檢測(cè)血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、以及肝臟組織超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)的活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,并采用多聚酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術(shù)檢測(cè)肝組織中IL-6的表達(dá)水平,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清中NF-α和IL-1β的水平。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用x±s表示,所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用析因設(shè)計(jì)方差分析。統(tǒng)計(jì)分析中,檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05。結(jié)果 1.大鼠再灌注后血清ALT和AST水平 我們檢測(cè)了各組大鼠血清中ALT和AST的含量,結(jié)果表明再灌注2h后,B組和C組的ALT和AST含量最高,術(shù)后24h大鼠血清ALT和AST值逐漸降低。在各時(shí)間段中,B組和C組的血清ALT和AST水平顯著高于A組,但C組的血清ALT和AST水平在個(gè)時(shí)間段均低于B組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.肝臟組織病理改變HE染色 結(jié)果顯示對(duì)照組肝細(xì)胞索排列正常、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞均正常；B組大鼠再灌注后12h,中央靜脈周圍的肝細(xì)胞明顯腫脹,肝血竇變窄,肝小葉結(jié)構(gòu)不明顯,伴有紅細(xì)胞和血栓,周圍出現(xiàn)浸潤的炎癥細(xì)胞；C組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常,肝細(xì)胞輕微腫脹,肝組織無明顯改變。 3.肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)損傷 缺血再灌注后12h,B組大鼠肝細(xì)胞線粒體體積大小不一,呈明顯腫脹狀態(tài),呈類圓形,內(nèi)有空泡變性,嚴(yán)重者可見嵴減少、斷裂或消失,周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)分別不清；C組大鼠肝細(xì)胞線粒體輕微腫脹,呈橢圓形,內(nèi)嵴部分?jǐn)嗔?多數(shù)正常排列,周圍內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)尚存。 4.缺血預(yù)適應(yīng)降低缺血再灌注后肝臟IL-6的表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示：B組各時(shí)間點(diǎn)的IL-6表達(dá)量均高于A組,C組6h、12h和24hIL-6表達(dá)量均高于A組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。B組中,再灌注后12h IL-6的表達(dá)最高,之后呈下降趨勢(shì)；C組2h、6h和12h的IL-6表達(dá)量均低于B組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 5.各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平變化 ELISA結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組相比,缺血再灌注損傷后B組和C組大鼠血清中TNF-a和IL-1p水平有不同程度的升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),在I/R后12h達(dá)到峰值；I/R后6h、12h、14h C組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平均低于B組(P0.05)。 6.各組肝臟組織中SOD及MDA的表達(dá)變化實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),B組與C組肝組織中的SOD活性均低于A組。各時(shí)間段中,C組SOD的表達(dá)略高于B組,其中術(shù)后6h和12h的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。B組與C組肝組織中的MDA達(dá)均高于A組。各時(shí)間段中,C組MDA的表達(dá)略低于B組,其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與B組相比,C組的肝組織在各時(shí)相中的丙二醛呈低水平表達(dá),超氧化物歧化酶活性較高,提示C組的自由基水平低于B組。 結(jié)論 缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠肝移植缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用,能夠顯著降低IL-6, TNF-a和IL-1p的表達(dá),降低肝細(xì)胞線粒體的損傷,在臨床中有一定的作用及意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R657.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2256140