【摘要】：在我國,肝病發(fā)病率較高,各類肝炎、肝硬化、肝癌、先天性與代謝性肝病等,一般的藥物治療和外科手術治療難以達到滿意的效果。因此,對肝臟移植手術有很大的需求。由于肝臟功能復雜、手術難度大、術后管理困難等因素,但肝臟在移植過程中往往會遭受不同程度的各種損傷,從而導致供肝術后肝功能不全、原發(fā)性移植肝無功能(Primary graft non-function, PNF)和移植物功能延遲恢復(delayed graft function, DGF)等。移植后肝功能不良和供肝保存欠佳、缺血再灌損傷(Ischemia-reperfusion, I/R)關系極為密切。研究表明,肝臟缺血再灌注損傷是導致早期移植后肝功能不全的最常見原因之一,同時也是影響肝移植手術后移植物長期存活的重要因素。我國又是世界上終末期肝病發(fā)病率最高的地區(qū)之一,肝病患者眾多,肝臟供需矛盾突出。因此,尋找一種安全有效的移植肝保存法,探究肝移植缺血再灌損傷機制已成為重要的研究課題。肝移植缺血再灌注損傷及相應炎癥反應常導致肝細胞損傷及壞死,如何避免肝細胞缺血再灌注損傷對疾病的治療及預后有著重要的價值。 缺血預適應(Ischemic preconditioning, IPC),也叫缺血預適應,是一種通過預先短暫缺血以耐受隨后較長時間的缺血損傷,并減輕組織后續(xù)缺血再灌注損傷的現象。1986年Murry等首次提出了缺血預處理這一概念。Laskey和Szmagala的臨床研究指出,缺血預適應可預防經皮腔內冠狀動脈成形術(Percutaneous transluminal coronary angioplasty, PTCA)和心臟手術所致的心肌缺血損傷。Toosy等首次研究發(fā)現了腎臟IPC對腎組織學損傷也具有保護作用。研究表明缺血預適應現象在其它許多器官都存在,如腦、肝、小腸、骨骼肌、腎和肺等,而且各組織器官之間存在交叉缺血耐受現象,例如骨骼肌、腎臟的短暫性缺血可有效減輕冠狀血管阻塞所致的心肌梗死灶的容積。缺血預適應對大鼠字體肝移植缺血再灌注損傷的保護作用及其機制還不明確,是與臨床肝移植手術減少肝組織損傷密切相關的課題。 白介素-6(Interleukin-6,IL-6)是細胞因子的核心成員之一,是廣泛表達于活化的B細胞、靜止的T細胞、骨髓瘤細胞、肝細胞、自然殺傷細胞、髓樣白血病細胞等細胞表面的一種具有多種生物學活性的刺激因子。IL-6主要由單核巨噬細胞和成纖維細胞產生,人類IL-6是由213個氨基酸組成的,可由腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor,T]NF)誘導產生并可增加TNF的有害作用,它具有誘導T、B淋巴細胞分化、刺激肝細胞合成急性期反應蛋白、催化和放大炎性反應和毒性等作用,對組織和細胞產生損害。IL-6作為一種多效性細胞因子,是參與免疫調節(jié)和炎性反應的重要因子之一,是機體對感染和組織損傷所引起應答反應的主要介質,能夠和集落刺激因子(Colony-stimulating factor, CSF)協同作用,促進骨髓源細胞的生長和分化,增強自然殺傷細胞的裂解功能。病毒、細菌感染均能誘導體內IL-6表達增加,在多種自身免疫疾病和腫瘤疾病中也表達異常。作為機體的保護機制,血清中IL-6水平升高對機體清除感染的病毒起到重要作用,此外,研究指出IL-6的表達水平與感染的嚴重程度、炎癥反應的程度呈正相關,可作為判斷病情嚴重程度的靈敏指標。 本研究首先構建大鼠自體肝移植缺血再灌注損傷模型,對缺血預適應組和對照組大鼠肝組織受損情況進行病理分析,然后對相關指標血漿谷草轉氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)和谷丙轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)的含量、IL-6的表達、超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase, SOD)活性和丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量進行檢測,分析血漿中IL-6、TNF-α和IL-1p的表達在缺血預適應組與對照組的差異,以及與肝組織損傷程度的相關性和可能的作用機制。本文旨在對肝移植缺血再灌注損傷的機制和保護性預適應進行研究,為肝移植缺血再灌注損傷的臨床治療和保護提供新的依據。 方法 首先建立大鼠門靜脈灌注的自體肝移植缺血再灌注模型,健康、成年、雄性SPF級純系SD大鼠72只,體重約280-300g,由南方醫(yī)科大學實驗動物中心提供。大鼠常規(guī)飼養(yǎng),術前禁食12h,不禁水。將72只SD大鼠隨機分為3組：正常大鼠對照組(A組)、大鼠肝移植組(B組)和缺血預適應大鼠肝移植組(C組)。B組大鼠直接行肝移植術。C組大鼠術前行肝臟缺血預適應,即夾閉肝門部肝動脈及門靜脈15min,后回復肝臟供血,20min后行大鼠自體肝移植。 采用乙醚棉球對準大鼠口鼻行開放式吸入麻醉。常規(guī)備皮、消毒后,取腹正中切口入腹。進腹后先用棉簽將整個腸道翻出腹腔外以利于術野暴露。然后用組織剪游離肝鐮狀韌帶后切斷,向右翻動肝左葉和中葉,暴露肝食管韌帶,結扎、切斷肝食管韌帶內血管,并以此為起點逆時針游離肝臟。首先沿食管向上分離,切斷左三角韌帶,縫扎、切斷左膈血管。然后向左翻轉肝臟,切斷右三角韌帶。再繼續(xù)向上游離肝上下腔靜脈(Suprahepatic vena cava,SVC)至膈靜脈裂孔,然后向下游離腔靜脈至右腎靜脈水平,期間結扎、切斷腰靜脈。游離肝腎韌帶,結扎切斷右腎上腺靜脈。肝臟復位,游離肝下下腔靜脈(Infrahepatic vena cava,IVC),將其分離至左腎靜脈水平以上。打開肝十二指腸韌帶,找出肝動脈(Hepatic artery,HA),將其分離并于動脈后方過線以備阻斷。繼續(xù)從腸系膜下靜脈和脾靜脈匯合處游離門靜脈(Portal vein,PV)至肝門部,期間需結扎幽門靜脈。最后鈍性分離肝胃韌帶,將肝兩片葉游離出來。至此肝臟全部游離完畢。將稀釋后的肝素注射液(35U/L)3mL通過穿刺針灌入門靜脈,使其完全肝素化。在髂總動脈與左腎動脈之間向近心端穿刺腹主動脈,用血管夾固定穿刺針,在腹腔干以上和穿刺點以下上血管夾阻斷。同時在SVC、IVC右腎靜脈水平上血管夾,并在IVC血管夾稍上方縱行剪開約1mm靜脈壁作為流出道。然后以2.5mL/min速度通過輸液泵同時經PV、腹主動脈穿刺處灌注4℃含肝素(12.5U/mL)的乳酸林格氏液20mL,在此同時不斷用4℃乳酸林格氏液澆注肝臟表面迅速降溫。當肝臟顏色變?yōu)榫鶆蛲咙S色時,灌注結束。灌注完成后拔出穿刺針,修補PV和腹主動脈穿刺點,用8-0prolene縫線修補IVC流出道,在肝動脈預留線處阻斷肝動脈并上血管夾,然后松開PV、SVC、IVC、腹主動脈的血管夾,恢復肝臟血供,結束無肝期。并同時用38℃生理鹽水澆注肝臟表面,快速復溫。肝動脈開放后,觀察腹腔內無出血點,連續(xù)縫合關腹。術后對大鼠進行燈照復溫,直至麻醉清醒可以站立。 各組大鼠再灌注2h、6h、12h和24h后,將大鼠麻醉,從下腔靜脈采血5ml,離心后吸取血清,-80℃冰箱保存,用于ALT.AST檢測。切取被阻斷的肝組織,林格氏液洗凈血液,修成小塊(厚度不超過0.5cm),一部分用10%中性甲醛固定,一部分保存于-80℃冰箱。 術后使用肝臟石蠟切片進行HE染色和電子顯微鏡觀察大鼠肝臟組織的病理學改變和肝細胞中線粒體顯微結構的變化。在各組大鼠缺血再灌注后2h、6h、12h、24h后,檢測血清中谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、以及肝臟組織超氧化物歧化酶(SuperoxideDismutase,SOD)的活性及丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量,并采用多聚酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)技術檢測肝組織中IL-6的表達水平,采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清中NF-α和IL-1β的水平。 實驗數據均用x±s表示,所有數據均采用IBM SPSS20.0統(tǒng)計軟件包進行數據分析,統(tǒng)計數據采用析因設計方差分析。統(tǒng)計分析中,檢驗標準為α=0.05。結果 1.大鼠再灌注后血清ALT和AST水平 我們檢測了各組大鼠血清中ALT和AST的含量,結果表明再灌注2h后,B組和C組的ALT和AST含量最高,術后24h大鼠血清ALT和AST值逐漸降低。在各時間段中,B組和C組的血清ALT和AST水平顯著高于A組,但C組的血清ALT和AST水平在個時間段均低于B組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 2.肝臟組織病理改變HE染色 結果顯示對照組肝細胞索排列正常、肝竇內皮細胞均正常；B組大鼠再灌注后12h,中央靜脈周圍的肝細胞明顯腫脹,肝血竇變窄,肝小葉結構不明顯,伴有紅細胞和血栓,周圍出現浸潤的炎癥細胞；C組大鼠肝小葉結構基本正常,肝細胞輕微腫脹,肝組織無明顯改變。 3.肝細胞的超微結構損傷 缺血再灌注后12h,B組大鼠肝細胞線粒體體積大小不一,呈明顯腫脹狀態(tài),呈類圓形,內有空泡變性,嚴重者可見嵴減少、斷裂或消失,周圍內質網結構分別不清；C組大鼠肝細胞線粒體輕微腫脹,呈橢圓形,內嵴部分斷裂,多數正常排列,周圍內質網結構尚存。 4.缺血預適應降低缺血再灌注后肝臟IL-6的表達 RT-PCR結果顯示：B組各時間點的IL-6表達量均高于A組,C組6h、12h和24hIL-6表達量均高于A組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。B組中,再灌注后12h IL-6的表達最高,之后呈下降趨勢；C組2h、6h和12h的IL-6表達量均低于B組,差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 5.各組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平變化 ELISA結果顯示,與正常對照組相比,缺血再灌注損傷后B組和C組大鼠血清中TNF-a和IL-1p水平有不同程度的升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),在I/R后12h達到峰值；I/R后6h、12h、14h C組大鼠血清中TNF-α和IL-1β水平均低于B組(P0.05)。 6.各組肝臟組織中SOD及MDA的表達變化實驗結果發(fā)現,B組與C組肝組織中的SOD活性均低于A組。各時間段中,C組SOD的表達略高于B組,其中術后6h和12h的差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。B組與C組肝組織中的MDA達均高于A組。各時間段中,C組MDA的表達略低于B組,其差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。與B組相比,C組的肝組織在各時相中的丙二醛呈低水平表達,超氧化物歧化酶活性較高,提示C組的自由基水平低于B組。 結論 缺血預適應對大鼠肝移植缺血再灌注損傷具有一定的保護作用,能夠顯著降低IL-6, TNF-a和IL-1p的表達,降低肝細胞線粒體的損傷,在臨床中有一定的作用及意義。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R657.3

【參考文獻】

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本文編號：2256140