發(fā)布時間：2018-09-19 09:52

【摘要】：膿毒癥是創(chuàng)傷、休克、感染、大手術(shù)等臨床危重癥患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一,是導(dǎo)致膿毒性休克(septic shock)和多器官功能障礙綜合癥(Multiple Organ Dysfunction Syndrome MODS)的重要因素,病死率居高不下,而膿毒癥合并急性腎損傷(Acute Renal Injury AKI)更是危重患者不良預(yù)后的獨(dú)立危險因素。流行病學(xué)資料顯示,在重癥監(jiān)護(hù)病房(Intensive Care Unit ICU)患者中,嚴(yán)重膿毒血癥和膿毒癥休克是AKI發(fā)生的最主要原因,約30%-50%的膿毒血癥患者發(fā)生AKI,膿毒癥致AKI約占所有病因引起AKI發(fā)生的50%左右。近年來,隨著AKI早期診斷和腎臟替代治療水平的不斷提高,AKI患者預(yù)后較以前有所改善,但值得關(guān)注的是,與非膿毒癥致AKI及單純膿毒血癥患者相比,膿毒癥致AKI患者死亡率顯著增加,維持在50%-70%左右。 膿毒癥致AKI之所以有如此高的死亡率,與其機(jī)制目前尚不明確息息相關(guān)。早期研究認(rèn)為休克狀態(tài)下腎的缺血/低灌注,即腎血流動力學(xué)改變所導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞壞死是膿毒癥AKI的主要病理生理機(jī)制,但越來越多的證據(jù)表明,腎血流量減少并非嚴(yán)重感染時腎損傷的核心機(jī)制,膿毒癥致AKI發(fā)生受多因素影響,除了血流動力學(xué)改變外,腎臟細(xì)胞凋亡、內(nèi)毒素誘發(fā)的復(fù)雜的炎癥和免疫網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)、內(nèi)皮功能紊亂、腎小球內(nèi)栓塞以及壞死細(xì)胞致腎小管阻塞等也參與其病理生理過程的改變,其中,腎小管上皮細(xì)胞凋亡可能在膿毒癥致AKI中起著關(guān)鍵性作用。在凋亡過程中有幾個蛋白水解酶家族被激活,Caspases是其中被研究最為深入的蛋白酶。Caspase-3是外源性的死亡受體途徑和內(nèi)源性的線粒體途徑共同激活的下游效應(yīng)子。有研究表明應(yīng)用Caspases印制劑降低了腎毒性物質(zhì)甘油-AKI、缺血再灌注-AKI、內(nèi)毒素(LPS)-AKI腎組織細(xì)胞凋亡,保護(hù)了腎功能。 沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶類(Sir2-related enzymes, Sirtuins),是一種高度保守的NAD+依賴的蛋白去乙�；割�,在基因沉默、基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞壽命以及代謝調(diào)節(jié)上具有必不可少的作用。既往對Sirt1研究主要聚焦其在與衰老相關(guān)疾病如肥胖、糖尿病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病及腫瘤中的作用,近年來,Sirtl激活對腎臟損傷保護(hù)性作用已成為腎臟病研究領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)研究表明,Sirtl可通過其抗氧化應(yīng)激、線粒體再生及抑制細(xì)胞凋亡等作用,參與氧化劑、順鉑以及缺血再灌注誘導(dǎo)腎臟損傷的保護(hù)。然而,迄今為止,關(guān)于Sirtl在膿毒血癥致AKI中作用國內(nèi)外未見報(bào)道。 本課題聚焦Sirtl在膿毒癥致腎臟損傷中的作用及其機(jī)制,通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecalligationandpuneture,CLP),制備膿毒癥AKI小鼠模型,運(yùn)用RT-PCR、 Western-blot、免疫組化等細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)手段,觀察Sirtl拮抗劑(EX527)干預(yù)后,膿毒癥AKI小鼠腎組織病理學(xué)、腎功能、腎損傷標(biāo)志物的變化、Sirtl基因mRNA和蛋白表達(dá)及腎組織細(xì)胞凋亡,腎組織Casepase-3表達(dá)的變化情況,來明確Sirtl是否對膿毒癥致AKI起保護(hù)作用,探討Sirtl是否可能通過下調(diào)Caspase-3的表達(dá)來減少腎組織的凋亡,從而達(dá)到保護(hù)腎功能的目的,為膿毒癥致AKI分子機(jī)制的闡明及防治靶點(diǎn)的確定提供新的理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分膿毒癥AKI小鼠模型制備 目的：探討一種簡單易行、接近臨床的膿毒癥致AKI小鼠模型的制備方法。 方法：健康清潔級雄性C57BL/6小鼠62只,隨機(jī)分為3組：①正常對照組(Normal組)：6只,不經(jīng)任何處理；②假手術(shù)組(Sham組)：28只,除不行盲腸結(jié)扎穿孔外,余同CLP組；③模型組(CLP組)：28只,按照Miyaji T的方法進(jìn)行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。假手術(shù)組和CLP組均在制模后設(shè)置6h、12h、24h三個時間點(diǎn),每組每個時間點(diǎn)6只小鼠,摘眼球取血檢測血清肌配(Cr)、尿素氮(BUN)水平,代謝籠收集尿液,檢測尿NGAL和KIM-1水平,光鏡下觀察腎組織病理學(xué)改變,每組余10只小鼠觀察生物學(xué)行為變化及4天、7天存活率。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD檢驗(yàn),應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算累計(jì)生存率并繪制生存曲線,生存曲線的比較采用log-rank檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果： 1.各組腎功能變化比較 Sham組在各時間點(diǎn)血清肌酐值與對照組相比,無顯著性差異(P0.05)。CLP組在CLP后6h肌酐有增高,但與Sham組相比無顯著性差異(P0.05),在術(shù)后12h、24h明顯升高,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01)。 Sham組在各時間點(diǎn)血清尿素氮值與對照組相比,無顯著性差異(P0.05)。CLP組在CLP后6h尿素氮即增高,在術(shù)后12h、24h維持高水平,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01)。 2.各組小鼠尿腎損傷標(biāo)志物變化比較 Sham組尿NAGL水平、尿KIM.1水平在術(shù)后6小時有增高,但與對照組相比,無顯著性差異(P0.05)。CLP組尿NAGL水平、尿KIM-1水平在術(shù)后各時間點(diǎn)均顯著升高,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01)。 3.各組小鼠腎臟病理改變及腎損傷病理評分結(jié)果 Sham組和正常對照組小鼠的腎臟組織結(jié)構(gòu)清晰,腎小管、腎小球正常,腎小管上皮細(xì)胞未見變性、萎縮、腫脹壞死或炎性浸潤,管腔無擴(kuò)張。 CLP組腎小球毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血,腎小管上皮細(xì)胞水腫、顆粒樣變性或空泡變性。 Sham組各時間點(diǎn)腎臟組織損傷病理評分與正常對照組相比,無顯著性差異；CLP組腎臟組織損傷病理評分在術(shù)后各時間點(diǎn)均顯著升高,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01)。 4.各組小鼠生物學(xué)行為與生存率的比較 Sham組小鼠麻醉蘇醒快,蘇醒后活動自如,進(jìn)食好,CLP組小鼠麻醉蘇醒慢,精神萎靡,氣促。Sham組4天、7天小鼠全部存活,CLP組4天、7天生存率分別為60%、30%,兩組比較有顯著性差異(P0.01)。 小結(jié) 1.CLP小鼠出現(xiàn)膿毒癥表現(xiàn),同時腎損傷標(biāo)志物和血清肌酐、尿素氮顯著增高,腎組織損傷病理評分顯著增高,表明膿毒癥致AKI模型制模成功。 2.通過控制實(shí)驗(yàn)動物的品種、年齡及CLP模型制作的標(biāo)準(zhǔn)化,可得到制備簡單、貼近臨床的膿毒癥致AKI模型。 第二部分Sirt1對膿毒癥致AKI的作用 目的：探討Sirt1在膿毒癥致AKI中的作用。 方法：健康清潔級雄性C57BL/6小鼠48只,隨機(jī)分為2組：①假手術(shù)組(Sham組)：24只,除不行盲腸結(jié)扎穿孔外,余同膿毒癥AKI組；②膿毒癥AKI組(septic AKI組)：24只,行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)。兩組均在制模后設(shè)置1天、3天、7天、14天四個時間點(diǎn),每個時間點(diǎn)6只小鼠,留取標(biāo)本,分別采用RT-PCR和Western Blot檢測腎皮質(zhì)Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表達(dá),余同第一部分,兩組間比較采用t檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1.兩組小鼠腎功能變化比較 Septic AKI組在CLP術(shù)后1天、3天血清肌酐、尿素氮值明顯升高,與Sham組相比有顯著性差異P0.01)；在術(shù)后7天、14天已下降到Sham組水平(P0.05)。 2.兩組小鼠尿腎損傷標(biāo)志物變化比較 Septic AKI組在術(shù)后1、3、7天尿NGAL和KIM-1水平均顯著升高,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01),14天尿NGAL和KIM-1水平均下降到Sham組水平(P0.05)。 3.兩組小鼠腎臟組織損傷病理評分結(jié)果 Septic AKI組在術(shù)后1、3、7天均顯著升高,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01),14天下降,與Sham組相比無顯著性差異(P0.05)。 4.兩組小鼠腎皮質(zhì)Sirt1基因表達(dá)變化 Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表達(dá)在第1天即升高,第3-7天達(dá)高峰,與Sham組相比有顯著性差異,(P0.01)；第14天Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表達(dá)下降到Sham組水平(P0.05)。 小結(jié)： 1.膿毒癥致AKI組小鼠在CLP術(shù)后早期就表現(xiàn)為腎臟Sirt1基因mRNA和蛋白表達(dá)都明顯升高,表明Sirt1基因在膿毒癥AKI早期就被激活 2.膿毒癥致AKI組小鼠腎臟Sirt1基因動態(tài)變化,提示內(nèi)源性Sirt1基因激活參與了膿毒癥致AKI的病理生理過程,結(jié)合文獻(xiàn),我們推測內(nèi)源性Sirt1基因激活可能對膿毒癥致AKI起保護(hù)作用,這還有待于下一步采用Sirt1抑制劑干預(yù)是否加重腎損傷來進(jìn)一步證實(shí)。 第三部分Sirt1在膿毒癥致AKI中的保護(hù)作用機(jī)制探討 目的：探討Sirt1對膿毒癥致AKI保護(hù)作用可能的機(jī)制,Sirt1是否通過Caspase-3的抑制,參與抑制腎小管上皮細(xì)胞凋亡作用,而起腎保護(hù)作用。 方法：健康清潔級雄性C57BL/6小鼠70只,隨機(jī)分為3組：①假手術(shù)組(Sham組)：10只,除不行盲腸結(jié)扎穿孔外,余同膿毒癥AKI組；②膿毒癥AKI組(septic AKI組)：30只,行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù),術(shù)后尾靜脈注射等量生理鹽水,每天1次,連續(xù)7天；③EX527干預(yù)組(EX527組)：30只,行盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)后,尾靜脈注射Sirt1拮抗劑(EX527,10mg/kg),每天1次,連續(xù)7天。觀察每組小鼠生物學(xué)行為變化及7天病死率,并予7天后每組隨機(jī)取6只存活小鼠,留取標(biāo)本,采用TUNEL法檢測腎組織細(xì)胞凋亡,采用免疫組化法檢測腎組織Caspase-3的表達(dá),余同第二部分。統(tǒng)計(jì)方法：對部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析,余同第一部分。 結(jié)果： 1.各組小鼠腎功能變化比較 膿毒癥AKI組血清肌酐、尿素氮水平已經(jīng)下降到Sham組水平,與膿毒癥AKI組相比,EX527干預(yù)組血清肌酐水平略升高,但無顯著性差異(P0.05),血清尿素氮水平升高,有顯著性差異(P0.05)。 2.各組小鼠尿腎損傷標(biāo)志物變化比較 膿毒癥AKI組尿NGAL、尿KIM-1顯著升高,與Sham組相比有顯著性差異(P0.01); EX527干預(yù)組與膿毒癥AKI組相比,升高更明顯,有顯著性差異(P0.01)。 3.各組小鼠腎臟組織損傷病理評分結(jié)果 膿毒癥AKI組與Sham組相比,有顯著性差異(P0.01); EX527干預(yù)組與膿毒癥AKI組相比,升高更明顯,有顯著性差異(P0.05)。 4.各組小鼠腎皮質(zhì)Sirt1基因表達(dá)變化 膿毒癥AKI組腎皮質(zhì)Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表達(dá)均明顯高于Sham組,有顯著性差異(P0.01);EX527干預(yù)組腎皮質(zhì)Sirt1基因mRNA及Sirt1基因蛋白表達(dá)均明顯下降,與膿毒癥AKI組相比有顯著性差異(P0.01)。 5.各組腎組織細(xì)胞凋亡率比較 TUNEL檢測結(jié)果表明Sham組凋亡細(xì)胞少,膿毒癥致AKI組細(xì)胞凋亡率明顯高于Sham組,分別為9.15±2.27和1.87±0.29,有顯著性差異(P0.01),EX527干預(yù)組(12.55±3.89)較膿毒癥致AKI組細(xì)胞凋亡數(shù)更增多(P0.05)。 6.各組腎組織caspase-3免疫組化表達(dá)的比較 Sham組caspase-3表達(dá)很少,主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中；膿毒癥致AKI組與Sham組相比較,caspase-3表達(dá)增多,在腎小管上皮細(xì)胞、腎小球血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)和胞核均有表達(dá),EX527干預(yù)組caspase-3表達(dá)較膿毒癥致AKI組更明顯。圖像分析顯示：三組之間capase-3表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01),其中膿毒癥致AKI組(7.48±±1.43)較Sham組(2.05±±0.31)明顯增高(P0.01),EX527干預(yù)組(9.44±2.12)較膿毒癥致AKI組有更高的表達(dá)率(P0.05)。 7.各組小鼠生存率的比較 Sham組7天小鼠全部存活,膿毒癥AKI組、EX527干預(yù)組7天生存率分別為36.67%、23.33%,三組之間生存率相比有顯著性差異,但膿毒癥AKI組與EX527干預(yù)組相比無顯著性差異(P0.05)。 8.相關(guān)性分析 腎組織細(xì)胞凋亡率、腎組織caspase-3表達(dá)與尿NGAL、尿KIM-1及腎臟病理評分成明顯正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.852、0.873、0.749及0.835、0.880、0.704,P均0.01。腎組織StirlmRNA、Sirt1蛋白表達(dá)與上述指標(biāo)沒有明顯相關(guān)性(P0.05)。在EX527干預(yù)組,腎組織StirlmRNA及蛋白表達(dá)與腎組織細(xì)胞凋亡率表達(dá)成明顯負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為-0.898和-0.836,P均0.05,與腎損傷標(biāo)志物尿NGAL、KIM-1及腎組織caspase-3表達(dá)亦成負(fù)相關(guān),但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 小結(jié)： 1.膿毒癥致AKI組小鼠腎組織細(xì)胞的凋亡率和腎組織Caspase-3的表達(dá)增加,且與腎損傷標(biāo)志物尿NGAL、KIM-1水平及腎臟損傷病理評分成正相關(guān),表明腎組織凋亡是膿毒癥致AKI的可能發(fā)病機(jī)制。 2. EX527干預(yù)組腎皮質(zhì)Sirt1基因mRNA和蛋白表達(dá)都明顯下降,但尿NGAL和KIM-1及腎小管損傷評分卻進(jìn)一步升高,證實(shí)抑制Sirt1基因表達(dá)加重膿毒癥致AKI的腎臟損害。 3.相關(guān)分析顯示EX527干預(yù)組小鼠腎皮質(zhì)Sirt1基因表達(dá)與腎組織細(xì)胞凋亡率成明顯負(fù)相關(guān),與Caspase-3表達(dá)成負(fù)相關(guān),但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,推測Sirt1抑制劑可能通過增加腎組織的凋亡從而加重了膿毒癥致AKI的腎臟損害,caspase-3可能是參與Sirt1抑制腎組織細(xì)胞凋亡的信號通路之一,但其并非唯一的途徑,有可能其他凋亡通路也參與其中,有待進(jìn)一步研究。綜合上述三部分內(nèi)容,本研究得出如下結(jié)論： 1.CLP能夠成功制備膿毒癥致AKI模型,通過控制實(shí)驗(yàn)動物的品種、年齡及模型制作的標(biāo)準(zhǔn)化,可得到貼近臨床的膿毒癥AKI模型,簡單、經(jīng)濟(jì)、可復(fù)制。 2.膿毒癥AKI早期內(nèi)源性Sirt1基因就被激活,對膿毒癥致AKI起保護(hù)作用。 3.膿毒癥時Sirt1基因激活,可能通過減少Caspase-3的表達(dá)來抑制腎細(xì)胞的凋亡而發(fā)揮腎保護(hù)作用,但Caspase-3并非唯一的途徑,其他凋亡通路可能也參與其中,有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R459.7

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2249790