【摘要】：研究背景：創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是一種日益增多的公共衛(wèi)生問題,涉及到巨大的社會成本,是全世界致殘率和致死率最主要的病因,尤其是兒童和青少年。TBI是一個漸進性的病理生理過程紊亂事件。最初,受傷當時的機械力損傷,可以導致神經元、軸索、膠質細胞和血管的直接機械性損傷。在原發(fā)性損傷后立即啟動一系列連續(xù)性復雜的病理生理過程,觸發(fā)大量的繼發(fā)性損傷級聯(lián)反應,最終導致漸進性組織損傷和細胞死亡,又稱繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷在創(chuàng)傷后數(shù)秒到數(shù)分鐘內啟動,可持續(xù)到數(shù)月或數(shù)年。繼發(fā)性損傷是TBI后神經退行性變和神經功能障礙的最重要的原因。一個重要的遲發(fā)性損傷機制涉及到細胞周期激活(cell cycle activation,CCA),導致成熟的神經元和/或少突膠質細胞的凋亡,以及小膠質細胞和星形膠質細胞的激活。研究表明,在TBI后,在腦組織中可檢測到細胞周期活化標記物的表達明顯增高,如Cyclin D1, CDK4, E2F5, c-myc,和PCNA。 MCMs是DNA復制過程中必不可少的重要物質,是啟動細胞周期S期的許可成分,并且能夠進一步使DNA從復制叉中的超螺旋狀態(tài)發(fā)揮微弱的解鏈酶作用。MCM7是高度保守的微小染色體維持蛋白家族成員之一,對于基因組復制的啟動是必須的。MCM7cDNA編碼一個543個氨基酸蛋白,在所有組織中均有表達。CD147,或細胞外基質金屬蛋白酶誘導物(EMMPRIN)是一種跨膜糖蛋白,也稱為Basigin(BSG),是由Basigin基因編碼。CD147是免疫球蛋白超級家族成員,主要組成了兩個細胞外免疫球蛋白域(C和V)。CD147在許多組織和細胞中表達,最先被發(fā)現(xiàn)存在于實體瘤細胞表面。CD147通過自主分泌和旁分泌方式刺激產生MMPs。在病理生理情況下,MMPs以蛋白水解的形式降解各種ECM中的成分和BBB的緊密連接蛋白,引起B(yǎng)BB破壞�；谏鲜鲑Y料,似乎MCM7和CD147可能涉及到TBI后的病理生理和生物化學過程,然而,在TBI中MCM7和CD147的表達和可能的作用尚未明確。我們本實驗的目的是想通過研MCM7和CD147的表達及其相互作用,來進一步明確MCM7、CD147與腦損傷后神經病理性改變的關系。第一部分MCM7在大鼠TBI中的表達變化及其作用機制的實驗研究微小染色體維持蛋白(Minichromosome maintenance protein, MCM)家族是DNA復制的調節(jié)器,確保復制的發(fā)生在一個細胞周期內只復制一次。MCM蛋白是DNA復制過程中必不可少的重要物質,是啟動細胞周期S期的許可成分,能夠進一步使DNA從復制叉中的超螺旋狀態(tài)發(fā)揮微弱的解鏈酶作用。MCM7是MCM家族中的一個成員,它的互補DNA (cDNA)編碼一個543個氨基酸蛋白,在所有的組織中廣泛表達。MCM7不但參與DNA復制過程,而且與MYCN轉錄因子相互作用,調節(jié)自己的轉錄。以前的研究已經證實,MCM7與CDK4有關,能夠直接與RB相互作用,參與DNA復制中細胞周期的控制。RB基因產物是控制細胞周期從G1到S期過渡的最重要的調節(jié)因子之一。最近的研究表明,位于MCM7基因內的miR106b簇能夠隨著CDK4/6以E2F和RB依賴性的模式抑制而有效地被抑制�；谏鲜鲑Y料,似乎MCM7可能涉及到TBI后的病理生理和生物化學過程,然而,在TBI中MCM7的表達和可能的作用尚未明確。在目前的研究中,我們首次研究了成年大鼠TBI模型損傷后MCM7的時間和空間上的表達模式,首次實驗驗證了MCM7的表達與CNS神經病理性疾病的關系。目的與方法通過建立成年鼠的TBI模型來研究MCM7在大鼠TBI后的表達的變化規(guī)律,并在細胞水平探討MCM7的功能及其在中樞神經系統(tǒng)病變和修復中的細胞和分子機制中的作用獲得更深的理解。健康雄性的S-D大鼠,隨機分為正常組、假手術組和手術組。手術組在右側皮層正中線旁開3mm處層做一個前后軸向外科切口。假手術組麻醉和外科準備后,只打開顱骨,而不進行皮層損傷。采用Western blot法檢測腦創(chuàng)傷后組織中的MCM7、PCNA及Caspase-3的表達。利用免疫組織化學法對MCM7在大鼠腦組織中的表達變化。然后通過雙免疫熒光標記法,進一步驗證MCM7在創(chuàng)傷性腦損傷中的空間表達特征。結果1、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,Western blot法MCM7在腦皮層組織中的表達變化蛋白免疫印跡法顯示在損傷周圍大腦皮層中,在正常和假手術組的皮層中MCM7的表達水平相對較低。但是在TBI損傷后12小時,損傷周圍大腦皮層中MCM7的表達逐漸增加,在第3天達到高峰,隨后逐漸下降,在TBI后第28天,MCM7的表達恢復到基線正常水平。而在正常組和假手術組中,MCM7的表達水平沒有任何變化。這些資料提示MCM7蛋白的表達水平在TBI后發(fā)生了時間上的變化。2、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,免疫組織化學法MCM7在腦皮層組織中的表達變化結果顯示,在損傷病灶的周圍的皮層腦組織細胞的胞漿內MCM明顯增多。然而,在對側半球的同側部位和未受損傷的假手術組中的腦組織中陽性染色較少。進一步放大倍數(shù)清晰地顯示,陽性染色的分布和形態(tài)學變化。結果顯示,在創(chuàng)傷性腦損傷后3天,在同側受損的腦組織皮層中MCM7的表達明顯高于損傷對側半球和假手術組。定量分析顯示,創(chuàng)傷性腦損傷3天后在對側和同側中,每平方毫米MCM7陽性細胞數(shù)在損傷側大腦皮層中MCM7表達明顯增高。3、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,雙免疫熒光標記法MCM7與損傷后不同特異性標記物表型的共定位我們發(fā)現(xiàn),MCM7在神經元、星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞中均廣泛表達。有趣的是,同假手術組相比,MCM7在受損的神經元和膠質細胞中的亞細胞定位是變化的。MCM7出現(xiàn)在假手術組腦組織中的神經元的神經核、星形膠質細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞中。然而,在創(chuàng)傷3天后,MCM7在受損腦組織的神經核和胞漿內有表達。結合上述資料實驗資料結果,我們推測MCM7可能參與了TBI后細胞周期的調控從而參與了神經元的凋亡和星形膠質細胞的增殖等生物學行為。4、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,在創(chuàng)傷性腦組織中活性Capase-3和MCM7的免疫活性關系我們采用Western blotting法檢測活性caspase-3的表達特點,結果發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后12h活性caspase-3開始逐漸升高,在TBI后3天達到高峰,在28天逐漸下降到基線水平。而我們的實驗結果證實,在TBI后MCM7的表達水平有時間特征性的變化,與活性caspase-3表達水平相比具有一致性。由此可以推測MCM7的表達與凋亡具有一定的相關性。為了進一步驗證MCM7與神經元凋亡的關系,我們采用免疫熒光標記法檢測是否NeuN/活性caspase-3,以及活性caspase-3/MCM7間存在共定位關系。在TBI后第三天,我們觀察到NeuN/活性caspase-3,以及活性caspase-3/MCM7間存在共定位關系。這些結果說明,MCM7和活性caspase-3的變化與顱腦損傷后的變化具有相關性。由此,可以推測MCM7可能通過影響活性caspase-3的表達而參與了創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經元的凋亡過程。5、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,MCM7與成人大鼠腦組織中細胞增殖的關系為了進一步驗證MCM7是否參與了TBI的細胞周期激活,我們通過Western blotting法首先檢測了PCNA的表達。結果顯示在TBI發(fā)生后,PCNA的蛋白表達水平增高,而且與MCM7的表達水平在時間依賴性模式是一致的。隨后,我們對TBI后3天的腦組織內PCNA和NeuN、GFAP、CDllb和MCM7進行了雙標記免疫熒光染色法檢測。在NeuN, GFAP,以及CD11b中檢測到MCM7/PCNA的共定位關系。這些結果證實了我們的推測,即MCM7可能通過細胞周期重新進入的信號通路參與了神經元的凋亡和膠質細胞的增殖反應。結論1、MCM7在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后的表達具有時間和空間的特征性變化規(guī)律：MCM7在顱腦損傷12小時后其表達水平逐漸升高,在3天時達到高峰,隨后逐漸下降,并在28天恢復至正常水平。2、MCM7在大鼠受損的腦皮層組織中MCM7在受損腦組織的神經核和胞漿內有表達。3、MCM7在蛋白水平的表達具有特征性變化,這種變化和caspase-3的變化具有一致性。提示MCM7在腦外傷后神經元細胞的凋亡方面具有一定作用,它具有促凋亡的生物學特性。4、MCM7在蛋白表達水平有特征性變化,這種變化及PCNA的變化具有一致性。提示MCM7可能參與了大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后膠質細胞的增殖。5、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的分子生物學變化與MCM7的生物學活性具有相關性。6、MCM7在大鼠腦外傷后受損的皮層中有特定的時間和空間表達模式。提示MCM7可以作為神經元損傷的重要的生物標記物。第二部分 MCM7和CD147在大鼠TBI中的相互作用及其作用機制的實驗研究細胞周期的精確調節(jié)對于許多的細胞過程至關重要,如增殖、分化、凋亡和癌變。在某些病理情況下,細胞周期激活機制影響成人中樞神經系統(tǒng)的正常功能,也參與了急性和慢性神經變形性疾病的病理生理過程�；|金屬蛋白酶是一組鋅依賴性肽鏈內切酶,在動物體內的生理和病理中具有多方面功能,主要參與細胞外基質(ECM)的降解。MMPs在正常生長、發(fā)育、傷口愈合、血管生成、神經發(fā)生、骨骼重構、排卵和移植方面起到明顯作用。然而,在病理生理情況下MMPs引起B(yǎng)BB破壞、出血、神經炎癥和細胞死亡。CD147,或細胞外基質金屬蛋白酶誘導物(EMMPRIN)是一種跨膜糖蛋白,是由Basigin基因編碼。CD147是免疫球蛋白超級家族成員,主要組成了兩個細胞外免疫球蛋白域(C和V)。我們前面的研究中,我們首次研究了成年大鼠TBI損傷后MCM7的時間和空間上的表達模式,首次實驗驗證了MCM7的表達與CNS神經病理性疾病的關系。但是對于MCM7是如何發(fā)揮作用的仍未明確,同時MCM7在腦創(chuàng)傷中是否參與了腦損傷后細胞周期的改變仍未明確。目的與方法我們通過建立成年鼠的TBI模型,來研究CD147在大鼠腦損傷后的表達的變化規(guī)律,并通過研究MCM7和CD147的相互作用,來進一步明確MCM7與腦損傷后神經病理性改變的關系。健康雄性的S-D大鼠,隨機分為正常組、假手術組和手術組。手術組在右側皮層正中線旁開3mm處層做一個前后軸向外科切口。假手術組麻醉和外科準備后,只打開顱骨,而不進行皮層損傷。采用Western blot法檢測腦創(chuàng)傷后組織中的CD147的時間的表達變化。利用免疫組織化學法監(jiān)測CD147在大鼠腦組織中空間表達變化。然后通過雙免疫熒光標記染色顯微鏡法檢測CD147在皮層組織中的定位情況。結果1、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,CD147在腦皮層組織中的表達變化蛋白免疫印跡顯示在損傷周圍大腦皮層中,在正常和假手術組的皮層中CD147的表達水平相對較低。但是在TBI損傷后12小時,損傷周圍大腦皮層中CD147的表達逐漸增加,在第3天達到高峰,隨后逐漸下降,在TBI后第28天,CD147的表達恢復到基線正常水平。而在正常組和假手術組中,CD147的表達水平沒有任何變化。這些資料提示CD147蛋白的表達水平在TBI后發(fā)生了時間上的變化(temporally change)。這種改變與MCM7的在顱腦損傷后的改變是一致的。說明這兩者可能存在一定的相互作用。2、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,免疫組織化學法CD147在腦皮層組織中的表達變化我們選擇在TBI后3天作為免疫組織化學法染色的時間截點,因此時CD147的表達達到高峰值。結果顯示,在損傷病灶的周圍的皮層腦組織細胞的胞漿內CD147明顯濃聚。然而,在對側半球的同側部位和未受損傷的假手術組中的腦組織中陽性染色較少。進一步放大倍數(shù)清晰地顯示,陽性染色的分布和形態(tài)學變化。結果顯示,在創(chuàng)傷性腦損傷后3天,在同側受損的腦組織皮層中CD147的表達明顯高于損傷對側半球和假手術組。定量分析顯示,創(chuàng)傷性腦損傷3天后在對側和同側中,每平方毫米CD147陽性細胞數(shù)在同側大腦皮層中MCM7表達明顯增高。3、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,雙免疫熒光標記染色法顯示CD147在腦皮層組織中的表達變化我們發(fā)現(xiàn),CD147在神經元、星形膠質細胞中均廣泛表達。有趣的是,我們觀察到,同假手術組相比,CD147在受損的神經元和膠質細胞中的亞細胞定位是變化的。CD147出現(xiàn)在假手術組腦組織中的神經元的神經核、星形膠質細胞中。然而,在創(chuàng)傷3天后,CD147在受損腦組織的神經核和胞漿內有表達。這種變化與MCM7的變化出奇的一致。結合上述資料實驗資料結果,我們推測MCM7可能通過CD147參與了TBI后神經元細胞周期的調控和膠質細胞的增殖等生物學行為。4、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,在創(chuàng)傷性腦組織中活性CD147和MCM7的免疫活性關系為了進一步驗證MCM7的表達與CD147的關系,我們采用免疫熒光標記法檢測是否CD147/MCM7間存在共定位關系。在TBI后第三天,我們觀察到CD147/MCM7間存在共定位關系。這些結果說明,MCM7和CD147的變化與顱腦損傷后的變化具有相關性。為了進一步確定兩者之間的關系,我們采用免疫共沉淀的方法研究兩者之間的關系,結果發(fā)現(xiàn)兩者存在免疫共性。由此,可以推測MCM7可能通過影響CD147的表達而參與了創(chuàng)傷性顱腦損傷后細胞周期過程。結論1、CD147在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后的表達具有時間和空間的特征性變化規(guī)律：與MCM7的表達變化具有一致性。2、MCM7與CD147在腦損傷后神經元及星形膠質細胞中表達變化一致。3、MCM7與CD147可能共同參與了腦損傷后神經元的凋亡及星形膠質細胞的增殖,可以為TBI的治療提供新的靶點。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R651.15
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本文編號：2185713