【摘要】：研究背景：創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury, TBI)是一種日益增多的公共衛(wèi)生問(wèn)題,涉及到巨大的社會(huì)成本,是全世界致殘率和致死率最主要的病因,尤其是兒童和青少年。TBI是一個(gè)漸進(jìn)性的病理生理過(guò)程紊亂事件。最初,受傷當(dāng)時(shí)的機(jī)械力損傷,可以導(dǎo)致神經(jīng)元、軸索、膠質(zhì)細(xì)胞和血管的直接機(jī)械性損傷。在原發(fā)性損傷后立即啟動(dòng)一系列連續(xù)性復(fù)雜的病理生理過(guò)程,觸發(fā)大量的繼發(fā)性損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致漸進(jìn)性組織損傷和細(xì)胞死亡,又稱繼發(fā)性損傷。繼發(fā)性損傷在創(chuàng)傷后數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)啟動(dòng),可持續(xù)到數(shù)月或數(shù)年。繼發(fā)性損傷是TBI后神經(jīng)退行性變和神經(jīng)功能障礙的最重要的原因。一個(gè)重要的遲發(fā)性損傷機(jī)制涉及到細(xì)胞周期激活(cell cycle activation,CCA),導(dǎo)致成熟的神經(jīng)元和/或少突膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡,以及小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活。研究表明,在TBI后,在腦組織中可檢測(cè)到細(xì)胞周期活化標(biāo)記物的表達(dá)明顯增高,如Cyclin D1, CDK4, E2F5, c-myc,和PCNA。 MCMs是DNA復(fù)制過(guò)程中必不可少的重要物質(zhì),是啟動(dòng)細(xì)胞周期S期的許可成分,并且能夠進(jìn)一步使DNA從復(fù)制叉中的超螺旋狀態(tài)發(fā)揮微弱的解鏈酶作用。MCM7是高度保守的微小染色體維持蛋白家族成員之一,對(duì)于基因組復(fù)制的啟動(dòng)是必須的。MCM7cDNA編碼一個(gè)543個(gè)氨基酸蛋白,在所有組織中均有表達(dá)。CD147,或細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(EMMPRIN)是一種跨膜糖蛋白,也稱為Basigin(BSG),是由Basigin基因編碼。CD147是免疫球蛋白超級(jí)家族成員,主要組成了兩個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白域(C和V)。CD147在許多組織和細(xì)胞中表達(dá),最先被發(fā)現(xiàn)存在于實(shí)體瘤細(xì)胞表面。CD147通過(guò)自主分泌和旁分泌方式刺激產(chǎn)生MMPs。在病理生理情況下,MMPs以蛋白水解的形式降解各種ECM中的成分和BBB的緊密連接蛋白,引起B(yǎng)BB破壞�；谏鲜鲑Y料,似乎MCM7和CD147可能涉及到TBI后的病理生理和生物化學(xué)過(guò)程,然而,在TBI中MCM7和CD147的表達(dá)和可能的作用尚未明確。我們本實(shí)驗(yàn)的目的是想通過(guò)研MCM7和CD147的表達(dá)及其相互作用,來(lái)進(jìn)一步明確MCM7、CD147與腦損傷后神經(jīng)病理性改變的關(guān)系。第一部分MCM7在大鼠TBI中的表達(dá)變化及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究微小染色體維持蛋白(Minichromosome maintenance protein, MCM)家族是DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)器,確保復(fù)制的發(fā)生在一個(gè)細(xì)胞周期內(nèi)只復(fù)制一次。MCM蛋白是DNA復(fù)制過(guò)程中必不可少的重要物質(zhì),是啟動(dòng)細(xì)胞周期S期的許可成分,能夠進(jìn)一步使DNA從復(fù)制叉中的超螺旋狀態(tài)發(fā)揮微弱的解鏈酶作用。MCM7是MCM家族中的一個(gè)成員,它的互補(bǔ)DNA (cDNA)編碼一個(gè)543個(gè)氨基酸蛋白,在所有的組織中廣泛表達(dá)。MCM7不但參與DNA復(fù)制過(guò)程,而且與MYCN轉(zhuǎn)錄因子相互作用,調(diào)節(jié)自己的轉(zhuǎn)錄。以前的研究已經(jīng)證實(shí),MCM7與CDK4有關(guān),能夠直接與RB相互作用,參與DNA復(fù)制中細(xì)胞周期的控制。RB基因產(chǎn)物是控制細(xì)胞周期從G1到S期過(guò)渡的最重要的調(diào)節(jié)因子之一。最近的研究表明,位于MCM7基因內(nèi)的miR106b簇能夠隨著CDK4/6以E2F和RB依賴性的模式抑制而有效地被抑制。基于上述資料,似乎MCM7可能涉及到TBI后的病理生理和生物化學(xué)過(guò)程,然而,在TBI中MCM7的表達(dá)和可能的作用尚未明確。在目前的研究中,我們首次研究了成年大鼠TBI模型損傷后MCM7的時(shí)間和空間上的表達(dá)模式,首次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MCM7的表達(dá)與CNS神經(jīng)病理性疾病的關(guān)系。目的與方法通過(guò)建立成年鼠的TBI模型來(lái)研究MCM7在大鼠TBI后的表達(dá)的變化規(guī)律,并在細(xì)胞水平探討MCM7的功能及其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變和修復(fù)中的細(xì)胞和分子機(jī)制中的作用獲得更深的理解。健康雄性的S-D大鼠,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和手術(shù)組。手術(shù)組在右側(cè)皮層正中線旁開(kāi)3mm處層做一個(gè)前后軸向外科切口。假手術(shù)組麻醉和外科準(zhǔn)備后,只打開(kāi)顱骨,而不進(jìn)行皮層損傷。采用Western blot法檢測(cè)腦創(chuàng)傷后組織中的MCM7、PCNA及Caspase-3的表達(dá)。利用免疫組織化學(xué)法對(duì)MCM7在大鼠腦組織中的表達(dá)變化。然后通過(guò)雙免疫熒光標(biāo)記法,進(jìn)一步驗(yàn)證MCM7在創(chuàng)傷性腦損傷中的空間表達(dá)特征。結(jié)果1、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,Western blot法MCM7在腦皮層組織中的表達(dá)變化蛋白免疫印跡法顯示在損傷周圍大腦皮層中,在正常和假手術(shù)組的皮層中MCM7的表達(dá)水平相對(duì)較低。但是在TBI損傷后12小時(shí),損傷周圍大腦皮層中MCM7的表達(dá)逐漸增加,在第3天達(dá)到高峰,隨后逐漸下降,在TBI后第28天,MCM7的表達(dá)恢復(fù)到基線正常水平。而在正常組和假手術(shù)組中,MCM7的表達(dá)水平?jīng)]有任何變化。這些資料提示MCM7蛋白的表達(dá)水平在TBI后發(fā)生了時(shí)間上的變化。2、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,免疫組織化學(xué)法MCM7在腦皮層組織中的表達(dá)變化結(jié)果顯示,在損傷病灶的周圍的皮層腦組織細(xì)胞的胞漿內(nèi)MCM明顯增多。然而,在對(duì)側(cè)半球的同側(cè)部位和未受損傷的假手術(shù)組中的腦組織中陽(yáng)性染色較少。進(jìn)一步放大倍數(shù)清晰地顯示,陽(yáng)性染色的分布和形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示,在創(chuàng)傷性腦損傷后3天,在同側(cè)受損的腦組織皮層中MCM7的表達(dá)明顯高于損傷對(duì)側(cè)半球和假手術(shù)組。定量分析顯示,創(chuàng)傷性腦損傷3天后在對(duì)側(cè)和同側(cè)中,每平方毫米MCM7陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在損傷側(cè)大腦皮層中MCM7表達(dá)明顯增高。3、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,雙免疫熒光標(biāo)記法MCM7與損傷后不同特異性標(biāo)記物表型的共定位我們發(fā)現(xiàn),MCM7在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中均廣泛表達(dá)。有趣的是,同假手術(shù)組相比,MCM7在受損的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位是變化的。MCM7出現(xiàn)在假手術(shù)組腦組織中的神經(jīng)元的神經(jīng)核、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中。然而,在創(chuàng)傷3天后,MCM7在受損腦組織的神經(jīng)核和胞漿內(nèi)有表達(dá)。結(jié)合上述資料實(shí)驗(yàn)資料結(jié)果,我們推測(cè)MCM7可能參與了TBI后細(xì)胞周期的調(diào)控從而參與了神經(jīng)元的凋亡和星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為。4、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,在創(chuàng)傷性腦組織中活性Capase-3和MCM7的免疫活性關(guān)系我們采用Western blotting法檢測(cè)活性caspase-3的表達(dá)特點(diǎn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)在創(chuàng)傷后12h活性caspase-3開(kāi)始逐漸升高,在TBI后3天達(dá)到高峰,在28天逐漸下降到基線水平。而我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在TBI后MCM7的表達(dá)水平有時(shí)間特征性的變化,與活性caspase-3表達(dá)水平相比具有一致性。由此可以推測(cè)MCM7的表達(dá)與凋亡具有一定的相關(guān)性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證MCM7與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系,我們采用免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)是否NeuN/活性caspase-3,以及活性caspase-3/MCM7間存在共定位關(guān)系。在TBI后第三天,我們觀察到NeuN/活性caspase-3,以及活性caspase-3/MCM7間存在共定位關(guān)系。這些結(jié)果說(shuō)明,MCM7和活性caspase-3的變化與顱腦損傷后的變化具有相關(guān)性。由此,可以推測(cè)MCM7可能通過(guò)影響活性caspase-3的表達(dá)而參與了創(chuàng)傷性顱腦損傷后神經(jīng)元的凋亡過(guò)程。5、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,MCM7與成人大鼠腦組織中細(xì)胞增殖的關(guān)系為了進(jìn)一步驗(yàn)證MCM7是否參與了TBI的細(xì)胞周期激活,我們通過(guò)Western blotting法首先檢測(cè)了PCNA的表達(dá)。結(jié)果顯示在TBI發(fā)生后,PCNA的蛋白表達(dá)水平增高,而且與MCM7的表達(dá)水平在時(shí)間依賴性模式是一致的。隨后,我們對(duì)TBI后3天的腦組織內(nèi)PCNA和NeuN、GFAP、CDllb和MCM7進(jìn)行了雙標(biāo)記免疫熒光染色法檢測(cè)。在NeuN, GFAP,以及CD11b中檢測(cè)到MCM7/PCNA的共定位關(guān)系。這些結(jié)果證實(shí)了我們的推測(cè),即MCM7可能通過(guò)細(xì)胞周期重新進(jìn)入的信號(hào)通路參與了神經(jīng)元的凋亡和膠質(zhì)細(xì)胞的增殖反應(yīng)。結(jié)論1、MCM7在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后的表達(dá)具有時(shí)間和空間的特征性變化規(guī)律：MCM7在顱腦損傷12小時(shí)后其表達(dá)水平逐漸升高,在3天時(shí)達(dá)到高峰,隨后逐漸下降,并在28天恢復(fù)至正常水平。2、MCM7在大鼠受損的腦皮層組織中MCM7在受損腦組織的神經(jīng)核和胞漿內(nèi)有表達(dá)。3、MCM7在蛋白水平的表達(dá)具有特征性變化,這種變化和caspase-3的變化具有一致性。提示MCM7在腦外傷后神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡方面具有一定作用,它具有促凋亡的生物學(xué)特性。4、MCM7在蛋白表達(dá)水平有特征性變化,這種變化及PCNA的變化具有一致性。提示MCM7可能參與了大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。5、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后的分子生物學(xué)變化與MCM7的生物學(xué)活性具有相關(guān)性。6、MCM7在大鼠腦外傷后受損的皮層中有特定的時(shí)間和空間表達(dá)模式。提示MCM7可以作為神經(jīng)元損傷的重要的生物標(biāo)記物。第二部分 MCM7和CD147在大鼠TBI中的相互作用及其作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究細(xì)胞周期的精確調(diào)節(jié)對(duì)于許多的細(xì)胞過(guò)程至關(guān)重要,如增殖、分化、凋亡和癌變。在某些病理情況下,細(xì)胞周期激活機(jī)制影響成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能,也參與了急性和慢性神經(jīng)變形性疾病的病理生理過(guò)程�；|(zhì)金屬蛋白酶是一組鋅依賴性肽鏈內(nèi)切酶,在動(dòng)物體內(nèi)的生理和病理中具有多方面功能,主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的降解。MMPs在正常生長(zhǎng)、發(fā)育、傷口愈合、血管生成、神經(jīng)發(fā)生、骨骼重構(gòu)、排卵和移植方面起到明顯作用。然而,在病理生理情況下MMPs引起B(yǎng)BB破壞、出血、神經(jīng)炎癥和細(xì)胞死亡。CD147,或細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)物(EMMPRIN)是一種跨膜糖蛋白,是由Basigin基因編碼。CD147是免疫球蛋白超級(jí)家族成員,主要組成了兩個(gè)細(xì)胞外免疫球蛋白域(C和V)。我們前面的研究中,我們首次研究了成年大鼠TBI損傷后MCM7的時(shí)間和空間上的表達(dá)模式,首次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了MCM7的表達(dá)與CNS神經(jīng)病理性疾病的關(guān)系。但是對(duì)于MCM7是如何發(fā)揮作用的仍未明確,同時(shí)MCM7在腦創(chuàng)傷中是否參與了腦損傷后細(xì)胞周期的改變?nèi)晕疵鞔_。目的與方法我們通過(guò)建立成年鼠的TBI模型,來(lái)研究CD147在大鼠腦損傷后的表達(dá)的變化規(guī)律,并通過(guò)研究MCM7和CD147的相互作用,來(lái)進(jìn)一步明確MCM7與腦損傷后神經(jīng)病理性改變的關(guān)系。健康雄性的S-D大鼠,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組和手術(shù)組。手術(shù)組在右側(cè)皮層正中線旁開(kāi)3mm處層做一個(gè)前后軸向外科切口。假手術(shù)組麻醉和外科準(zhǔn)備后,只打開(kāi)顱骨,而不進(jìn)行皮層損傷。采用Western blot法檢測(cè)腦創(chuàng)傷后組織中的CD147的時(shí)間的表達(dá)變化。利用免疫組織化學(xué)法監(jiān)測(cè)CD147在大鼠腦組織中空間表達(dá)變化。然后通過(guò)雙免疫熒光標(biāo)記染色顯微鏡法檢測(cè)CD147在皮層組織中的定位情況。結(jié)果1、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,CD147在腦皮層組織中的表達(dá)變化蛋白免疫印跡顯示在損傷周圍大腦皮層中,在正常和假手術(shù)組的皮層中CD147的表達(dá)水平相對(duì)較低。但是在TBI損傷后12小時(shí),損傷周圍大腦皮層中CD147的表達(dá)逐漸增加,在第3天達(dá)到高峰,隨后逐漸下降,在TBI后第28天,CD147的表達(dá)恢復(fù)到基線正常水平。而在正常組和假手術(shù)組中,CD147的表達(dá)水平?jīng)]有任何變化。這些資料提示CD147蛋白的表達(dá)水平在TBI后發(fā)生了時(shí)間上的變化(temporally change)。這種改變與MCM7的在顱腦損傷后的改變是一致的。說(shuō)明這兩者可能存在一定的相互作用。2、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,免疫組織化學(xué)法CD147在腦皮層組織中的表達(dá)變化我們選擇在TBI后3天作為免疫組織化學(xué)法染色的時(shí)間截點(diǎn),因此時(shí)CD147的表達(dá)達(dá)到高峰值。結(jié)果顯示,在損傷病灶的周圍的皮層腦組織細(xì)胞的胞漿內(nèi)CD147明顯濃聚。然而,在對(duì)側(cè)半球的同側(cè)部位和未受損傷的假手術(shù)組中的腦組織中陽(yáng)性染色較少。進(jìn)一步放大倍數(shù)清晰地顯示,陽(yáng)性染色的分布和形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果顯示,在創(chuàng)傷性腦損傷后3天,在同側(cè)受損的腦組織皮層中CD147的表達(dá)明顯高于損傷對(duì)側(cè)半球和假手術(shù)組。定量分析顯示,創(chuàng)傷性腦損傷3天后在對(duì)側(cè)和同側(cè)中,每平方毫米CD147陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在同側(cè)大腦皮層中MCM7表達(dá)明顯增高。3、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,雙免疫熒光標(biāo)記染色法顯示CD147在腦皮層組織中的表達(dá)變化我們發(fā)現(xiàn),CD147在神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞中均廣泛表達(dá)。有趣的是,我們觀察到,同假手術(shù)組相比,CD147在受損的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位是變化的。CD147出現(xiàn)在假手術(shù)組腦組織中的神經(jīng)元的神經(jīng)核、星形膠質(zhì)細(xì)胞中。然而,在創(chuàng)傷3天后,CD147在受損腦組織的神經(jīng)核和胞漿內(nèi)有表達(dá)。這種變化與MCM7的變化出奇的一致。結(jié)合上述資料實(shí)驗(yàn)資料結(jié)果,我們推測(cè)MCM7可能通過(guò)CD147參與了TBI后神經(jīng)元細(xì)胞周期的調(diào)控和膠質(zhì)細(xì)胞的增殖等生物學(xué)行為。4、大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后,在創(chuàng)傷性腦組織中活性CD147和MCM7的免疫活性關(guān)系為了進(jìn)一步驗(yàn)證MCM7的表達(dá)與CD147的關(guān)系,我們采用免疫熒光標(biāo)記法檢測(cè)是否CD147/MCM7間存在共定位關(guān)系。在TBI后第三天,我們觀察到CD147/MCM7間存在共定位關(guān)系。這些結(jié)果說(shuō)明,MCM7和CD147的變化與顱腦損傷后的變化具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步確定兩者之間的關(guān)系,我們采用免疫共沉淀的方法研究?jī)烧咧g的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者存在免疫共性。由此,可以推測(cè)MCM7可能通過(guò)影響CD147的表達(dá)而參與了創(chuàng)傷性顱腦損傷后細(xì)胞周期過(guò)程。結(jié)論1、CD147在大鼠創(chuàng)傷性顱腦損傷后的表達(dá)具有時(shí)間和空間的特征性變化規(guī)律：與MCM7的表達(dá)變化具有一致性。2、MCM7與CD147在腦損傷后神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)變化一致。3、MCM7與CD147可能共同參與了腦損傷后神經(jīng)元的凋亡及星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖,可以為TBI的治療提供新的靶點(diǎn)。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R651.15
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本文編號(hào)：2185713