本文選題：心肌肥厚 + 螺內(nèi)酯��； 參考：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：心肌肥厚是心臟對(duì)急、慢性血流動(dòng)力學(xué)超負(fù)荷和非血流動(dòng)力學(xué)因素的一種基本的適應(yīng)性反應(yīng),是高血壓、瓣膜病、急性心肌梗死及先天性心臟病等心血管疾病的一種常見的并發(fā)癥。心肌肥厚使心力衰竭和心臟性猝死的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。心肌肥厚的發(fā)生過程中腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)被激活。應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑（ACEI）或血管緊張素受體阻斷劑（ARB）可降低心衰病人的死亡率和發(fā)病率。然而僅僅抑制血管緊張素Ⅱ并不能完全阻斷醛固酮的生成，大約有40%的心衰病人在應(yīng)用血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑治療時(shí)仍伴有醛固酮增高。越來越多的研究表明，醛固酮參與了心肌肥厚、心衰過程。隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)表明，醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑合用降低了心肌梗死后充血性心力衰竭患者的死亡率。因此，心力衰竭治療的臨床實(shí)踐指南推薦醛固酮受體拮抗劑作為心衰患者的一線治療藥物。然而，應(yīng)用醛固酮受體拮抗劑進(jìn)行治療的同時(shí)增加了并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)，特別是高鉀血癥，可引起嚴(yán)重的心律失常事件。因此，在臨床上聯(lián)合使用醛固酮受體拮抗劑引發(fā)高血鉀的擔(dān)憂減少了醛固酮受體拮抗劑在心衰治療中的應(yīng)用，特別是高血壓伴早期心肌肥厚性重構(gòu)的治療是否應(yīng)用醛固酮受體阻斷劑尚無定論。 近幾年，越來越多的實(shí)驗(yàn)研究中采用“低劑量”醛固酮受體拮抗劑，盡管不同的實(shí)驗(yàn)研究采用螺內(nèi)酯（spironolactone，Sp）的劑量各異，一般接受的概念是低劑量指不影響血壓的劑量。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在過表達(dá)腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因大鼠，低劑量Sp（1mg/kg）與傳統(tǒng)使用的劑量(30mg/kg)具有相當(dāng)?shù)男呐K保護(hù)作用。臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低于常規(guī)用量下的螺內(nèi)酯與其他一線降壓藥合用可以發(fā)揮顯著腎臟保護(hù)作用。上述研究結(jié)果提示，低于傳統(tǒng)排鈉利尿用量的“低劑量”Sp具有臟器保護(hù)作用，此作用不依賴于其血流動(dòng)力學(xué)的改變。而臨床研究發(fā)現(xiàn)低劑量Sp引發(fā)高血鉀的風(fēng)險(xiǎn)顯著減低。由此我們假定，在不影響腎臟排鈉、儲(chǔ)鉀的低劑量下，醛固酮受體拮抗劑與ACEI或ARB抗心衰藥物聯(lián)合應(yīng)用可以對(duì)抗心臟肥厚性重構(gòu)，同時(shí)又可避免高血鉀的風(fēng)險(xiǎn)。為驗(yàn)證上述假設(shè)，本研究首先利用壓力超負(fù)荷致心肌肥厚大鼠模型，評(píng)價(jià)“低劑量” Sp（不影響血鉀）與ARB類藥物厄貝沙坦（irbesartan，Ir）聯(lián)用對(duì)心肌肥厚性重構(gòu)的有效性，并與常規(guī)劑量下Sp的作用進(jìn)行比較。同時(shí)測(cè)定血清鉀濃度，評(píng)估其誘發(fā)高血鉀的風(fēng)險(xiǎn)；并觀察低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，以探討兩藥聯(lián)合效應(yīng)的潛在藥理機(jī)制。此外，本研究利用核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)基因敲除小鼠，觀察Nrf2在外源性醛固酮誘導(dǎo)心肌肥厚中的調(diào)控作用。研究預(yù)期為臨床醛固酮受體拮抗劑應(yīng)用于心肌肥厚、心衰的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分低劑量螺內(nèi)酯與厄貝沙坦聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠心肌肥厚性重構(gòu)的影響 目的：本研究利用壓力超負(fù)荷致心肌肥厚大鼠模型，評(píng)價(jià)“低劑量”醛固酮受體拮抗劑螺內(nèi)酯與血管緊張素受體阻斷劑厄貝沙坦聯(lián)用對(duì)心肌肥厚性重構(gòu)的有效性，并與常規(guī)劑量下螺內(nèi)酯的作用進(jìn)行比較。同時(shí)測(cè)定血清K濃度，評(píng)估其誘發(fā)高血鉀的風(fēng)險(xiǎn)。 方法：選用雄性SD大鼠，腹主動(dòng)脈部分縮窄（PAAC）法制備心肌肥厚模型。造模4周后用超聲診斷儀測(cè)定心室壁厚度。隨后進(jìn)行隨機(jī)分組：假手術(shù)組，模型組，厄貝沙坦（15mg/kg/d）組，低劑量螺內(nèi)酯（1mg/kg/d）+厄貝沙坦（15mg/kg/d）組，常規(guī)劑量螺內(nèi)酯（20mg/kg/d）+厄貝沙坦（15mg/kg/d）組。灌胃給藥4周后，超聲心動(dòng)圖測(cè)定心室壁厚度及心臟收縮功能參數(shù)；右側(cè)頸動(dòng)脈插管至心室腔，記錄麻醉動(dòng)物的血壓及左室壓力變化等血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)；計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)（左心室重/體重，LVW/BW）；HE染色及Masson染色觀察心肌細(xì)胞肥大程度及心肌間質(zhì)膠原沉積情況； RT-PCR法檢測(cè)心肌組織ANP、β-MHC、Procollagen I、TGF-β等心肌肥厚、纖維化相關(guān)生物標(biāo)志物的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠LVW/BW的影響：藥物治療結(jié)束，各組大鼠體重?zé)o明顯差別。左心室質(zhì)量指數(shù)（LVW/BW）可用來反映由于壓力超負(fù)荷所致心肌肥厚。和假手術(shù)組相比，模型組左心室質(zhì)量指數(shù)明顯增大（p 0.01）。與模型組相比，單用Ir使左心室質(zhì)量指數(shù)有所下降，但無明顯差異；低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用均可降低左心室質(zhì)量指數(shù)（p 0.01），但低劑量與高劑量之間無明顯差別。提示低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用可降低壓力超負(fù)荷所致左心室質(zhì)量指數(shù)的增加，且其作用與常規(guī)劑量Sp相當(dāng)。 2低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠超聲心動(dòng)圖參數(shù)的影響：腹主動(dòng)脈狹窄術(shù)后4周動(dòng)物的室間隔厚度（IVs）、左室后壁厚度（LVPW）均明顯增大，而左室內(nèi)徑（LVd）明顯降低（p 0.05或p 0.01），射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）無明顯改變。說明PAAC引起心肌肥厚，收縮功能尚正常，處于代償階段，模型成功。藥物治療結(jié)束后，各組大鼠的EF及FS基本一致(p均0.05)，提示心臟整體收縮功能尚正常。單用Ir對(duì)IVs、LVPW、LVd無明顯影響；低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用均可降低IVs、LVPW，而增大LVd，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p 0.05），提示低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用均可降低PAAC所致心肌肥厚，二者作用無明顯差別，低劑量Sp作用與常規(guī)劑量Sp作用相當(dāng)。 3低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響：模型組收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）均明顯升高，左室舒張末壓（LVEDP）增高及dp/dtmin/LVSP降低(p均0.05)，但dp/dtmax和假手術(shù)組大鼠基本一致，說明腹主動(dòng)脈狹窄術(shù)后8周大鼠主要表現(xiàn)為左室舒張功能受損，而心臟整體收縮功能正常。此結(jié)果與超聲心動(dòng)圖所得結(jié)果一致。單用厄貝沙坦治療對(duì)SBP、DBP、LVEDP及dp/dtmin/LVSP無明顯影響，但低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用均可降低SBP、DBP，且可拮抗PAAC所致LVEDP的增高及dp/dtmin/LVSP的降低。提示低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用不僅逆轉(zhuǎn)了心肌肥厚，而且改善了左室舒張功能，且低劑量Sp可達(dá)到與常規(guī)劑量相似的作用。 4低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)各組大鼠心肌組織的病理改變的影響：HE染色結(jié)果顯示：和假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌細(xì)胞橫截面面積明顯增加(p 0.01)。單用Ir對(duì)心肌細(xì)胞橫截面面積無明顯影響，但I(xiàn)r聯(lián)合應(yīng)用低劑量或常規(guī)劑量Sp均明顯降低了心肌細(xì)胞橫截面面積(p均0.05)，提示Ir聯(lián)合應(yīng)用低劑量或常規(guī)劑量Sp治療改善了心肌細(xì)胞的肥厚程度，且低劑量Sp可達(dá)到與常規(guī)劑量相似的作用。Masson染色結(jié)果顯示：和假手術(shù)組相比，模型組大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維明顯增多，排列紊亂。Ir干預(yù)組心肌膠原積聚明顯減輕，排列也趨于規(guī)則。Ir聯(lián)合應(yīng)用低劑量或常規(guī)劑量Sp較單獨(dú)Ir對(duì)心肌間質(zhì)纖維化改善程度更加明顯(p均0.05)。提示低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用可降低壓力超負(fù)荷所致左心室心肌纖維化，且其作用與常規(guī)劑量Sp相當(dāng)。 5低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌肥大及纖維化相關(guān)生物標(biāo)志物的影響：心肌肥厚不僅表現(xiàn)為心肌細(xì)胞肥大及間質(zhì)纖維化程度增加，還表現(xiàn)為肥大基因及促纖維化基因的上調(diào)。因此，我們觀察了各組大鼠心肌肥大基因ANP及β-MHC，促纖維化基因procollagen I和TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果表明，腹主動(dòng)脈狹窄術(shù)后8周大鼠心肌ANP、β-MHC、procollagen I和TGF-β1的表達(dá)明顯增強(qiáng)(p均0.01)。單獨(dú)應(yīng)用Ir削弱了左室ANP、β-MHC、procollagen I和TGF-β1mRNA的表達(dá)，但統(tǒng)計(jì)無顯著差異，，Ir聯(lián)合應(yīng)用低劑量或常規(guī)劑量Sp (p均0.05)可明顯降低左室ANP、β-MHC、procollagen I和TGF-β1mRNA的表達(dá)。提示低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用可抑制壓力超負(fù)荷所致左心室心肌肥大基因及促纖維化基因上調(diào)，且其作用與常規(guī)劑量Sp相當(dāng)。 6低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血鉀、鈉的影響：應(yīng)用醛固酮拮抗劑最重要和常見的不良反應(yīng)就是高血鉀癥，為了比較低劑量或常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用的作用，我們進(jìn)一步觀察了各組對(duì)血鉀、鈉的影響。和對(duì)照組相比，常規(guī)劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用明顯使血鉀濃度增加，但低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)血鉀無明顯影響。各組血鈉均無明顯改變。提示低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用不會(huì)引起血鉀增高，此點(diǎn)優(yōu)于常規(guī)劑量Sp。 結(jié)論：低劑量螺內(nèi)酯與厄貝沙坦聯(lián)合應(yīng)用可改善腹主動(dòng)脈縮窄所致心肌肥厚、心肌纖維化及心臟舒張功能。此作用與常規(guī)劑量螺內(nèi)酯與厄貝沙坦聯(lián)合應(yīng)用相似。常規(guī)劑量螺內(nèi)酯與Ir聯(lián)合應(yīng)用明顯升高血鉀，而低劑量對(duì)血鉀無影響。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低劑量醛固酮受體拮抗劑與ARB合用具有顯著的抗心肌肥厚作用，同時(shí)可以降低高血鉀風(fēng)險(xiǎn)。 第二部分低劑量螺內(nèi)酯與厄貝沙坦聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈部分縮窄所致氧化應(yīng)激的影響 目的：觀察低劑量螺內(nèi)酯（Sp）和厄貝沙坦（Ir）聯(lián)合用藥對(duì)腹主動(dòng)脈部分縮窄（PAAC）大鼠心肌組織氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響，探討聯(lián)合用藥改善壓力超負(fù)荷所致左室肥厚及舒張功能障礙的潛在藥理機(jī)制。 方法：選用雄性SD大鼠，腹主動(dòng)脈部分縮窄制備心肌肥厚模型。造模4周后進(jìn)行隨機(jī)分組：假手術(shù)組，模型組，厄貝沙坦（15mg/kg/d）組，低劑量螺內(nèi)酯（1mg/kg/d）組，低劑量螺內(nèi)酯（1mg/kg/d）+厄貝沙坦（15mg/kg/d）組。灌胃給藥4周后，生化法測(cè)定心肌組織丙二醛（MaleicDialdehyde, MDA）水平。采用光澤精化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法測(cè)定左室心肌組織的NADPH氧化酶活動(dòng)度。采用氮藍(lán)四唑顯色法法測(cè)定心肌組超氧化物歧化酶（SOD）活性。Western blot技術(shù)分析心肌組織NADPH氧化酶（NOX）亞基NOX2、NOX4及SOD亞基SOD-1、SOD-2蛋白表達(dá)。 結(jié)果： 1Ir、低劑量Sp和低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌MDA含量的影響:通過測(cè)定心肌組織丙二醛（Maleic Dialdehyde, MDA）水平來間接評(píng)估心肌組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。和假手術(shù)組相比，模型組心肌MDA含量明顯增多（p0.01），表明PAAC引起心肌氧化應(yīng)激損傷。應(yīng)用Ir單藥或低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用均可降低PAAC所致心肌MDA水平的增加（p0.05或p0.01）。與單藥相比，聯(lián)合用藥進(jìn)一步降低了心肌的MDA水平（p0.05）。上述結(jié)果提示Ir可顯著改善心肌的氧化應(yīng)激狀態(tài)，但I(xiàn)r與低劑量Sp聯(lián)合應(yīng)用效果更佳。 2Ir、低劑量Sp和低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌NADPH氧化酶活性的影響: NADPH氧化酶為心肌組織中活性氧簇生成的主要酶之一，所以我們觀察了NADPH氧化酶在心肌中的改變。和假手術(shù)組相比，模型組心肌NADPH氧化酶活性明顯增強(qiáng)（p0.01），應(yīng)用Ir、低劑量Sp單藥或低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用均有降低NADPH氧化酶活性的趨勢(shì)，但只有低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.05）。與單獨(dú)應(yīng)用低劑量Sp相比，聯(lián)合用藥進(jìn)一步降低了心肌的NADPH氧化酶活性（p0.05）。 3Ir、低劑量Sp和低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌NADPH氧化酶亞型蛋白表達(dá)的影響:為了進(jìn)一步說明NADPH氧化酶活性改變的機(jī)制，我們應(yīng)用免疫印跡的方法觀察心肌NADPH氧化酶亞型NOX2、NOX4的改變。和假手術(shù)組相比，模型組心肌NADPH氧化酶NOX4亞型蛋白表達(dá)明顯增多（p0.01），但NOX2亞型無明顯改變。說明PAAC所致心肌氧化應(yīng)激損傷可能與NADPH氧化酶NOX4亞型表達(dá)增加有關(guān)。和模型組相比，單用Ir或低劑量Sp均對(duì)NOX4亞型無明顯影響；但低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用顯著降低了NOX4亞型蛋白表達(dá)（p0.05）。上述結(jié)果說明Ir與低劑量Sp聯(lián)合應(yīng)用對(duì)NOX4亞型蛋白表達(dá)的抑制效果更佳，提示低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用降低PAAC所致心肌氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制可能與其對(duì)NOX4的影響有關(guān)。 4Ir、低劑量Sp和低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌SOD活性的影響: SOD為一線的活性氧簇清除酶，推測(cè)PAAC所致氧化應(yīng)激與SOD功能失調(diào)有關(guān)。所以我們觀察了SOD在心肌中的改變。和假手術(shù)組相比，模型組心肌SOD活性明顯降低（p0.05）。和模型組相比，單用Ir或低劑量Sp均對(duì)SOD活性有增強(qiáng)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用顯著增加SOD活性（p0.05）。 5Ir、低劑量Sp和低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用對(duì)心肌SOD亞型蛋白表達(dá)的影響:為了進(jìn)一步說明SOD改變的機(jī)制，我們應(yīng)用免疫印跡的方法觀察心肌SOD亞型SOD-1、SOD-2的改變。PAAC使心肌SOD-2蛋白表達(dá)明顯減少（p0.01），但SOD-1無明顯改變。單用Ir或低劑量Sp均對(duì)SOD-2表達(dá)有增強(qiáng)趨勢(shì)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用則顯著增加SOD-2表達(dá)（p0.05）。上述結(jié)果說明Ir與低劑量Sp聯(lián)合應(yīng)用對(duì)SOD-2蛋白表達(dá)的增強(qiáng)效果更佳，提示低劑量Sp與Ir聯(lián)合應(yīng)用降低PAAC所致心肌氧化應(yīng)激損傷的機(jī)制可能與其對(duì)SOD-2的影響有關(guān)。 結(jié)論： 1腹主動(dòng)脈縮窄引起大鼠心肌組織MDA含量增高，NADPH氧化酶活性及NOX4亞基表達(dá)增強(qiáng)，SOD活性降低及SOD-2亞基表達(dá)降低，提示NADPH氧化酶和SOD介導(dǎo)的氧化應(yīng)激參與了PAAC大鼠心肌肥厚和心臟舒張功能失調(diào)的進(jìn)程。 2低劑量螺內(nèi)酯與厄貝沙坦聯(lián)合應(yīng)用可降低PAAC所致心肌氧化應(yīng)激損傷，其可能是通過抑制NADPH氧化酶和增強(qiáng)SOD活性而發(fā)揮作用。 第三部分Nrf2轉(zhuǎn)錄因子在醛固酮所致小鼠心肌肥厚中的調(diào)控作用 目的：為進(jìn)一步深入探討醛固酮致心肌肥厚的機(jī)制，本研究擬采用Nrf2基因敲除小鼠，觀察核因子NF-E2相關(guān)因子(nuclear factor erythroid2-related factor2，Nrf2)在外源性醛固酮誘導(dǎo)心肌肥厚中的調(diào)控作用。 方法：實(shí)驗(yàn)中Nrf2+/+、Nrf2-/-ICR小鼠有河北醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科李春巖院士惠贈(zèng)。對(duì)所用動(dòng)物的基因型進(jìn)行從DNA水平、mRNA水平、蛋白水平進(jìn)行鑒定。選用健康雄性Nrf2+/+、Nrf2-/-小鼠，按體重隨機(jī)分為四組，分別為：Nrf2+/+對(duì)照組、Nrf2+/+醛固酮組、Nrf2-/-對(duì)照組、Nrf2-/-醛固酮組。醛固酮組小鼠采用皮下植泵方式給藥，醛固酮用量為1mg/kg/day，連續(xù)給藥28天。對(duì)照組進(jìn)行假手術(shù)。應(yīng)用小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)（707B，30Hz）對(duì)心臟進(jìn)行超聲測(cè)定心室壁厚度及心臟收縮功能。碘[125I]醛固酮放射免疫分析藥盒放射免疫γ計(jì)數(shù)器測(cè)定各組小鼠血中醛固酮的濃度。計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)（心臟重/體重，HW/BW），急性胰酶法消化心肌細(xì)胞，負(fù)載DCFH-DA染料觀察心肌氧化應(yīng)激水平。Western blot技術(shù)分析心肌組織Nrf2蛋白表達(dá)。RT-PCR法檢測(cè)心肌組織Nrf2及其下游抗氧化酶血紅素加氧酶（heme oxygenase， HO-1）,依賴還原型輔酶Ⅰ/Ⅱ:醌氧化還原酶（NAD(P)H:quinone oxidoreductase1，NQO1）的mRNA表達(dá)。 結(jié)果： 1Nrf2基因敲除小鼠鑒定結(jié)果：分別從DNA、mRNA、蛋白水平鑒定小鼠基因型。通過鼠尾提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，Nrf2-/-小鼠擴(kuò)增產(chǎn)物條帶位于400bp左右位置，而野生型（Nrf2+/+）小鼠的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物位于700bp；提取心肌mRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增，野生型小鼠表達(dá)Nrf2mRNA， Nrf2-/-小鼠無Nrf2mRNA表達(dá)；提取心肌蛋白進(jìn)行免疫印跡，野生型小鼠表達(dá)Nrf2蛋白，Nrf2-/-小鼠無Nrf2蛋白表達(dá)。 2小鼠體內(nèi)醛固酮血藥濃度的測(cè)定：Nrf2+/+對(duì)照組、Nrf2+/+醛固酮組血藥濃度為0.32±0.07ng/mL，1.79±0.52ng/mL，Nrf2-/-對(duì)照組、Nrf2-/-醛固酮組血藥濃度為0.23±0.05ng/mL，1.48±0.44ng/mL，各醛固酮組血藥濃度明顯高于相應(yīng)對(duì)照組（p0.05），表明滲透壓泵可以將醛固酮釋放到小鼠體內(nèi)，使醛固酮在體內(nèi)的含量明顯增加。 3小鼠心臟超聲心動(dòng)圖改變：各組小鼠的射血分?jǐn)?shù)（EF）、短軸縮短率（FS）基本一致(p均0.05)，提示心臟整體收縮功能正常。Nrf2+/+對(duì)照組、Nrf2-/-對(duì)照組的左室舒張末期前壁厚度(LVID)、左室舒張末期后壁厚度(LVPW)、EF、FS等指標(biāo)相差不大，無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p均0.05)。提示基因敲除Nrf2對(duì)心臟基本形態(tài)和功能無明顯影響。和相應(yīng)的對(duì)照組相比，醛固酮組LVID、LVPW均明顯增大。與Nrf2+/+醛固酮組相比，Nrf2-/-醛固酮組LVID、LVPW明顯增大（p0.05）。結(jié)果說明醛固酮可引起左室心肌肥厚，敲除Nrf2可加重醛固酮所致心肌肥厚。 4小鼠心臟質(zhì)量指數(shù)的變化：Nrf2+/+對(duì)照組、Nrf2+/+醛固酮組心臟質(zhì)量指數(shù)為3.92±0.08，4.34±0.31，Nrf2-/-對(duì)照組、Nrf2-/-醛固酮組心臟質(zhì)量指數(shù)為3.91±0.31，4.99±0.17。顯然，與野生型相比，Nrf2基因敲除并不影響心臟質(zhì)量指數(shù)，給予醛固酮后心臟質(zhì)量指數(shù)明顯高于相應(yīng)對(duì)照組（p0.05），表明醛固酮增加心臟重量。與Nrf2+/+醛固酮組相比，Nrf2-/-醛固酮組心臟質(zhì)量指數(shù)明顯增大（p0.05）。提示Nrf2基因敲除可使醛固酮對(duì)心臟質(zhì)量指數(shù)的作用增強(qiáng)。 5小鼠心肌肥厚生物標(biāo)志物ANP、β-MHC mRNA表達(dá)變化：與相應(yīng)的對(duì)照組相比，醛固酮可使心肌肥大基因ANP、β-MHC mRNA表達(dá)量均明顯增加（p0.01）。與Nrf2+/+醛固酮組相比，Nrf2-/-醛固酮組ANP、β-MHC mRNA表達(dá)量增加更為明顯（p0.01）。提示Nrf2基因敲除增強(qiáng)了醛固酮對(duì)心肌肥厚生物標(biāo)志物影響的作用。 6醛固酮對(duì)小鼠心肌ROS水平的影響：以上結(jié)果說明醛固酮可引起心肌肥厚，已知氧化應(yīng)激在心肌肥厚發(fā)展中有重要作用，所以我們利用熒光探針DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測(cè)進(jìn)一步觀察了醛固酮對(duì)心肌的氧化應(yīng)激的影響。與相應(yīng)的對(duì)照組相比，Nrf2+/+醛固酮組、Nrf2-/-醛固酮組心肌細(xì)胞ROS水平均明顯增加，分別增加約1.7、2.8倍（p0.01）。與Nrf2+/+醛固酮組相比，Nrf2-/-醛固酮組ROS水平均明顯增大（p0.01）。提示醛固酮可引起左室心肌氧化應(yīng)激損傷，敲除Nrf2可加重醛固酮所致心肌氧化應(yīng)激損傷。 7醛固酮對(duì)野生型小鼠心臟Nrf2的影響：以上結(jié)果說明醛固酮可引起小鼠心肌肥厚、氧化應(yīng)激增強(qiáng)，且敲除Nrf2可加重醛固酮致心肌肥厚、氧化應(yīng)激的作用。為了進(jìn)一步說明Nrf2在醛固酮致心肌肥厚中的作用，我們通過熒光定量PCR、免疫印跡技術(shù)觀察醛固酮對(duì)小鼠心臟Nrf2表達(dá)的影響。醛固酮使Nrf2mRNA及蛋白水平均明顯增加。提示醛固酮可上調(diào)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，可能醛固酮激活了Nrf2轉(zhuǎn)錄因子及其下游抗氧化酶通路。 8醛固酮對(duì)小鼠心臟抗氧化酶HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)的影響：既然醛固酮可上調(diào)Nrf2轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，那么醛固酮對(duì)Nrf2的下游抗氧化基因有無影響？所以我們進(jìn)一步觀察醛固酮對(duì)Nrf2的下游抗氧化酶HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果表明，醛固酮使心肌HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)明顯增加,但敲除Nrf2-/-后，醛固酮不會(huì)引起使HO-1、NQO-1mRNA表達(dá)增加，而使NQO-1mRNA表達(dá)明顯降低。提示醛固酮可通過Nrf2上調(diào)抗氧化酶HO-1、NQO-1的表達(dá)，從而抑制醛固酮所致心肌氧化應(yīng)激損傷及心肌肥厚。 結(jié)論：敲除Nrf2基因可加重醛固酮所致小鼠心肌肥厚，提示Nrf2參與了醛固酮所致心肌肥厚的調(diào)控作用。醛固酮上調(diào)心肌Nrf2轉(zhuǎn)錄因子，改變其下游抗氧化酶表達(dá)，提示醛固酮在致心肌肥厚的同時(shí)亦啟動(dòng)Nrf2-抗氧化酶通路，該通路對(duì)心肌肥厚發(fā)揮抑制作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R965

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1973675