發(fā)布時間：2018-05-27 05:24

  本文選題：W1 + 氯吡格雷�。� 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：W1作為一個新型合成化合物,其結(jié)構(gòu)包含2-O-氯吡格雷和阿司匹林,前者為氯吡格雷在體內(nèi)的第一步氧化代謝產(chǎn)物。W1的合成理念主要基于氯吡格雷的前藥屬性,且其代謝產(chǎn)物的不穩(wěn)定性,旨在減輕或克服氯吡格雷臨床使用中存在的主要問題。氯吡格雷在臨床上廣泛應(yīng)用于抗血栓治療,其體內(nèi)活化過程需要經(jīng)過肝臟CYP450酶的兩步氧化代謝,其代謝酶的主要亞型為CYP2C19和CYP3A4。因此,氯吡格雷的藥效通常受到機(jī)體CYP450酶活性的影響,比如患者出現(xiàn)上述酶活性先天不足或配伍給藥使得酶活性被抑制的情形,后者包括質(zhì)子泵抑制劑(如奧美拉唑)或降膽固醇藥物(如他汀類藥物)等臨床常用藥物,這些因素皆可使氯吡格雷無法達(dá)到預(yù)期療效,即出現(xiàn)“氯吡格雷抵抗”現(xiàn)象,這已成為氯吡格雷最令人擔(dān)心的問題。我們前期的藥效學(xué)研究表明,W1具有強(qiáng)于氯吡格雷的抗血小板效應(yīng),而且能夠明顯減輕“氯吡格雷抵抗”現(xiàn)象。本研究主要就W1的作用機(jī)制進(jìn)行分析,著重觀察其對血小板ADP受體P2Y12信號通路的影響,此外,還對可能影響氯吡格雷藥效的配伍藥物奧美拉唑和辛伐他汀進(jìn)行了相關(guān)研究。第一部分,W1對血小板ADP受體信號通路的影響。我們以Wistar大鼠為實驗對象,將動物分為三個組:正常對照組、氯吡格雷組(10mg/kg)和W1組(3mg/kg),氯吡格雷和W1分別以0.5%的甲基纖維素(MC)溶液充分混懸,二者均為單次給藥,采用灌胃口服途徑,正常對照組僅服用等體積的MC混懸液。各組動物給藥后4小時,麻醉并抽取腹主動脈血液,離心制備洗滌血小板,分別用于adp受體信號通路分子的蛋白表達(dá)檢測和血小板鋪展實驗。在信號分子的蛋白表達(dá)檢測中,各組動物血小板以adp(終濃度為50μm)處理5分鐘,正常對照動物血小板另設(shè)非adp處理組。adp處理完畢,提取血小板蛋白,通過westernblot方法檢測磷酸化akt、erk蛋白以及rap1蛋白的表達(dá)情況。在進(jìn)行血小板鋪展實驗時,以fitc-鬼筆環(huán)肽染色血小板,在激光共聚焦顯微鏡下對血小板加以觀察,通過測定單個血小板面積反映其鋪展情況。westernblot檢測結(jié)果表明,與正常對照組相比,w1給藥組大鼠血小板的磷酸化akt、erk蛋白及rap1蛋白的表達(dá)均受到抑制,氯吡格雷組可觀察到同樣的結(jié)果。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,與正常對照組相比,w1及氯吡格雷給藥組大鼠血小板的面積明顯減小,表明w1可以抑制血小板在纖維蛋白原上的鋪展,阻斷了纖維蛋白原受體的活化。第二部分,辛伐他汀對氯吡格雷的影響。將wistar大鼠分為三組:氯吡格雷(10mg/kg)組、氯吡格雷(10mg/kg)+辛伐他汀(40mg/kg)組、氯吡格雷(10mg/kg)+辛伐他汀(80mg/kg)組,各組均為單次灌胃口服給藥。按照第一部分的主要方法,觀察辛伐他汀配伍給藥對氯吡格雷的影響。結(jié)果表明,大鼠血小板在akt磷酸化蛋白表達(dá)及面積變化方面,未檢測到辛伐他汀對氯吡格雷產(chǎn)生顯著影響。為進(jìn)一步分析原因,一方面,我們將辛伐他汀(10-10、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5m)作用于hepg2培養(yǎng)細(xì)胞,分別以q-pcr及westernblot檢測細(xì)胞cyp3a4在mrna和蛋白的表達(dá)水平;另一方面,將辛伐他汀(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5m)與表達(dá)人cyp450s同工酶和人cyp450s還原酶的昆蟲細(xì)胞微粒體共同孵育,通過熒光強(qiáng)度的變化分析辛伐他汀對cyp3a4酶活性的影響。結(jié)果表明,辛伐他汀沒有影響到hepg2細(xì)胞cyp3a4在mrna和蛋白水平的表達(dá),對體外肝微粒體cyp3a4的酶活性亦未產(chǎn)生明顯影響。第三部分,奧美拉唑?qū)epG2細(xì)胞CYP2C19表達(dá)的影響。將奧美拉唑(0、0.1、1、10 mg/L)作用于HepG2細(xì)胞24小時,采用Q-PCR及Western blot檢測細(xì)胞中CYP2C19的mRNA和蛋白表達(dá)。奧美拉唑(0、0.1、1、10、100 mg/L)與表達(dá)人CYP450s同工酶和人CYP450s還原酶的昆蟲細(xì)胞的微粒體共同孵育,在體外水平上通過熒光強(qiáng)度的變化分析奧美拉唑?qū)YP2C19酶活性的影響。結(jié)果顯示,在mRNA及蛋白表達(dá)水平上,奧美拉唑各濃度組均抑制CYP2C19酶的表達(dá),且具有濃度依賴性。酶活性檢測表明,當(dāng)奧美拉唑的濃度達(dá)到10 mg/L、100 mg/L時,熒光強(qiáng)度明顯減弱,表明高濃度的奧美拉唑抑制CYP2C19酶的表達(dá)。結(jié)論:W1可明顯抑制大鼠血小板Akt、Erk及Rap1的蛋白表達(dá),而它們正是ADP受體信號通路的重要分子,提示W(wǎng)1通過作用于ADP受體發(fā)揮其抗血小板作用;在大鼠體內(nèi)未檢測到辛伐他汀對氯吡格雷產(chǎn)生明顯影響,包括在血小板的Akt表達(dá)和面積變化方面,而且對HepG2細(xì)胞CYP3A4的表達(dá)和對微粒體CYP3A4酶活性亦無影響;奧美拉唑能夠降低HepG2細(xì)胞色素氧化酶CYP2C19的表達(dá),也可抑制體外肝微粒體該酶的活性。
[Abstract]:In this study , the effect of clopidogrel on platelet ADP receptor signaling pathway was studied . The effect of clopidogrel on platelet ADP receptor signaling pathway was studied . The effects of simvastatin ( 10 - 10 , 10 - 9 , 10 - 8 , 10 - 7 , 10 - 6 , 10 - 5 m ) on the activity of clopidogrel in HepG2 cells were investigated . The results showed that simvastatin ( 10 - 10 , 10 - 9 , 10 - 8 , 10 - 7 , 10 - 6 , 10 - 5 m ) had no significant effect on the activity of human CYP450s and human CYP450s .
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R96

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1940628