本文選題：結(jié)核分枝桿菌 + 恥垢分枝桿菌��； 參考：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：結(jié)核病（tuberculosis，TB）是由分枝桿菌屬中的結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriumtuberculosis，MTB）感染引起的慢性傳染性疾病，主要通過氣溶膠形式在人群中傳播。自上世紀(jì)九十年代以來，MTB耐藥菌株的出現(xiàn)和增加、TB合并人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）感染患者的增多、人口流動性增加，特別是目前唯一可用于預(yù)防TB的疫苗——卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin vaccine，BCG）對成人的保護(hù)效果欠佳等原因，使得TB疫情不能得到有效控制。因此，研制新的預(yù)防性或兼具治療性的TB疫苗，是TB防治研究中的重要內(nèi)容。 目前TB的傳播難以得到有效控制的主要原因有：1）MTB感染機體后，MTB特殊的脂質(zhì)表面結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其可在巨噬細(xì)胞內(nèi)長期存活，以持留菌的形式或潛伏狀態(tài)存在，而感染者并不出現(xiàn)臨床癥狀或癥狀輕微，這些潛伏感染者的發(fā)病是新增TB病例的主要來源；2）耐藥菌株增加，尤其是多重耐藥性MTB的出現(xiàn)和流行，使得原用于TB治療的化學(xué)藥物對耐藥菌的作用甚微。因此，針對MTB耐藥性以及持續(xù)性感染狀態(tài)，研發(fā)新的TB預(yù)防和治療制劑及藥物、探索新的治療措施和途徑具有重要意義。 分枝桿菌屬中的恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis，MS）是一種能夠快速生長的、非致病性的分枝桿菌，能夠高效表達(dá)外源性基因，是TB新型疫苗研究的理想候選載體�？乖�85B（Ag85B）和6kDa早期分泌靶抗原（6kDa early secretedantigen target，ESAT-6）均為MTB感染早期分泌表達(dá)的免疫優(yōu)勢抗原，以其為靶抗原單獨或融合后構(gòu)建的基因疫苗、亞單位疫苗和重組BCG等均能有效刺激機體產(chǎn)生特異性的抗MTB免疫應(yīng)答。此外，國內(nèi)外研究表明，MTB熱休克蛋白65（heat shockprotein65，Hsp65）及輔助性T細(xì)胞1型（Th1）細(xì)胞因子——白細(xì)胞介素2（Interleukin-2，IL-2）也均能有效刺激機體產(chǎn)生對MTB的免疫應(yīng)答。 【研究目的】 以MS為表達(dá)載體，構(gòu)建能夠分泌表達(dá)Ag85B-ESAT-6融合蛋白的重組MS（rMS），觀察rMS誘導(dǎo)小鼠特異性免疫應(yīng)答尤其是細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力；評價其作為治療性疫苗單獨或與抗TB化學(xué)藥物聯(lián)合應(yīng)用對MTB耐藥株感染小鼠及MTB標(biāo)準(zhǔn)株低劑量感染小鼠的免疫治療效果。 【實驗方法和研究結(jié)果】 1.重組恥垢分枝桿菌（Ag85B-ESAT-6-rMS）的構(gòu)建及鑒定 以MTB H37Rv株（標(biāo)準(zhǔn)株）基因組DNA為模版，多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChain Reaction，PCR）擴增ag85B基因片段和攜帶疏水性氨基酸殘基基因連接片段（linker）的esat-6基因片段。經(jīng)T4連接酶連接后，PCR擴增獲得融合基因ag85B-linker-esat-6。將融合基因克隆入pMD18-T載體后，再將其亞克隆至大腸埃希菌-分枝桿菌穿梭分泌表達(dá)載體pDE22中，進(jìn)行酶切鑒定和序列測定。結(jié)果顯示，可切出預(yù)期大小片段，測序分析表明ag85B和esat-6基因與GenBank公布的序列完全一致，將其命名為pDE22-ag85B-esat-6。 將pDE22-ag85b-esat-6電穿孔轉(zhuǎn)化MS感受態(tài)細(xì)菌，提取質(zhì)粒后采用酶切法進(jìn)行基因型鑒定，結(jié)果證明切出的目的基因片段大小與預(yù)期一致。將基因型鑒定正確的rMS菌株經(jīng)42℃熱誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE分析并采用抗Ag85B的多克隆抗體和抗ESAT-6的單克隆抗體對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot鑒定。結(jié)果表明rMS菌可分泌表達(dá)Ag85B-ESAT-6融合蛋白，證明rMS構(gòu)建成功，將其命名為Ag85B-ESAT-6-rMS。 2. Ag85B-ESAT-6-rMS誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答 方法：取6~8周齡雌性BALB/c小鼠75只，隨機分成5組（每組15只），即Ag85B-ESAT-6-rMS組、BCG組、MS組、純化的Ag85B-ESAT-6融合蛋白（AE）組及生理鹽水對照組。rMS組和MS組分別經(jīng)背部皮下注射相應(yīng)細(xì)菌1×107CFU/只，間隔2周，共免疫3次；BCG組經(jīng)背部皮下注射BCG1×107CFU/只，僅免疫1次；AE組經(jīng)腹股溝皮下包埋含20μg AE的硝酸纖維素膜，間隔3周，共免疫2次。初次免疫后第1周起，每周采集各組小鼠尾靜脈血（共采集6周），無菌分離外周血單核細(xì)胞（PBMC），分析CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分比；初次免疫后第6周，乙醚麻醉后處死小鼠，無菌法取各組小鼠脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，分別檢測其特異性增殖指數(shù)（SI）、CTL殺傷活性，以及分泌IFN-γ、IL-2和IL-4的淋巴細(xì)胞頻數(shù)。 結(jié)果：①Ag85B-ESAT-6-rMS免疫組小鼠的PBMC中CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞所占百分比之和均高于其他各組（P0.05）；②Ag85B-ESAT-6-rMS免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞SI高于生理鹽水組、AE免疫組和MS免疫組（P0.05），而與BCG免疫組相比無顯著差異（P0.05）；③Ag85B-ESAT-6-rMS免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞CTL殺傷效率高于生理鹽水組和MS組（P0.05），與AE免疫組和BCG免疫組比無顯著差異（P0.05）；④Ag85B-ESAT-6-rMS免疫組小鼠的脾淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-2的細(xì)胞頻數(shù)分別高于其他各組（P0.05），分泌IL-4的細(xì)胞頻數(shù)與BCG免疫組和MS免疫組相比無顯著差異（P0.05）。以上結(jié)果表明，Ag85B-ESAT-6-rMS可誘導(dǎo)小鼠強烈的免疫應(yīng)答，并以Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答為主。 3. Ag85B-ESAT-6-rMS對MTB耐利福平株感染小鼠模型的免疫治療 方法：①取MTB耐利福平（Rifampin，RFP）株經(jīng)尾靜脈注射感染6~8周齡的雌性BALB/c小鼠（1×106CFU/只），感染后第4周，無菌分離小鼠脾臟和肺臟，制作組織切片，進(jìn)行HE染色觀察和抗酸染色檢查，平板計數(shù)法分別檢測兩臟器的荷菌數(shù)（CFU）。②與上述同樣方法用MTB耐RFP株感染小鼠，并將感染小鼠隨機分為8組（15只/組），即異煙肼（Isoniazid，INH）治療組、RFP治療組、Ag85B-ESAT-6-rMS治療組、 Hsp65-IL-2-rMS治療組、 INH+Ag85B-ESAT-6-rMS聯(lián)合治療組、INH+Hsp65-IL-2-rMS聯(lián)合治療組、 MS治療組、生理鹽水對照組。其中Ag85B-ESAT-6-rMS組、Hsp65-IL-2-rMS組和MS組分別在感染后6周和10周經(jīng)小鼠背部皮下注射1×107CFU的rMS或MS；聯(lián)合治療組在感染后第6周開始用INH給小鼠灌胃治療，持續(xù)4周，第10周時再經(jīng)小鼠背部皮下分別注射1×107CFU的兩種rMS；RFP組和INH組自感染后第6周開始灌胃治療，持續(xù)8周。③觀察并記錄各組小鼠活動及體重變化情況；在治療后第4周和第8周，分別無菌分離小鼠脾臟和肺臟，同上進(jìn)行抗酸染色檢查、HE染色觀察，并進(jìn)行荷菌數(shù)檢測。④治療后統(tǒng)計各組小鼠存活率。 結(jié)果：①感染小鼠模型肺和脾中均可見抗酸桿菌（+++），HE染色可見慢性肉芽腫性炎的表現(xiàn)，肺和脾荷菌數(shù)分別達(dá)105和104CFU，表明MTB耐RFP株感染小鼠模型建立成功；②生理鹽水組、RFP組和MS組的小鼠體重均呈下降趨勢，INH+Ag85B-ESAT-6-rMS組、INH+Hsp65-IL-2-rMS組、Ag85B-ESAT-6-rMS組和Hsp65-IL-2-rMS組的小鼠體重均呈顯著增長趨勢（P0.05）；③治療后第4周和第8周各組小鼠肺組織中抗酸染色鏡檢的結(jié)果顯示，生理鹽水組和RFP組均呈強陽性（++++或+++），其次為MS組（+++），而Ag85B-ESAT-6-rMS組和Hsp65-IL-2-rMS組為（++），INH+Ag85B-ESAT-6-rMS組、INH+Hsp65-IL-2-rMS組和INH組均為（+）；④治療后第4周和第8周各組小鼠肺組織HE染色觀察結(jié)果顯示，各組小鼠肺組織均呈慢性炎癥反應(yīng)，除INH組外其他各組均呈慢性肉芽腫性炎的表現(xiàn)，肺間質(zhì)增生并纖維化，表明MS和rMS可引起小鼠肺組織一定程度的病理損傷；⑤治療后第4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS組、Hsp65-IL-2-rMS組、INH+Ag85B-ESAT-6-rMS組、INH+Hsp65-IL-2-rMS組和INH組小鼠脾和肺的荷菌數(shù)（log10CFU）均低于生理鹽水對照組（P0.05），表明兩種rMS均能有效抑制MTB耐RFP株在小鼠組織中的增殖，具有免疫治療作用，與INH聯(lián)合應(yīng)用時的治療效果較單獨用rMS的治療效果更好；⑥r(nóng)MS與INH聯(lián)合治療組小鼠存活率均高于rMS單獨治療組和MS組，但是與生理鹽水對照組無差別，結(jié)果提示各組存活率排序除與小鼠MTB臟器荷菌數(shù)的多少有關(guān)之外，還與小鼠肺組織顯示的病理損傷（間質(zhì)增生并纖維化）程度一致。 4. Ag85B-ESAT-6-rMS對MTB H37Rv株低劑量感染小鼠的免疫治療 方法：①取MTB H37Rv株經(jīng)尾靜脈注射感染6~8周齡的雌性C57BL/6小鼠（1×104CFU/只），分別于感染第6周和第10周時，無菌分離小鼠脾和肺臟，制作組織切片進(jìn)行抗酸染色檢查和HE染色觀察，平板計數(shù)法計臟器荷菌數(shù)（CFU）。②與上述同樣方法用MTB H37Rv株感染小鼠，并將其隨機分為4組（30只/組），即Ag85B-ESAT-6-rMS治療組、RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS聯(lián)合治療組、RFP/INH治療組和感染模型對照組；各組治療均在感染后第10周開始，其中Ag85B-ESAT-6-rMS治療組經(jīng)背部皮下注射1×107CFU/只，間隔4周后同樣方法免疫第2次；RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS聯(lián)合治療組先用RFP/INH通過飲水治療4周后，再用Ag85B-ESAT-6-rMS通過皮下注射治療，劑量同上，間隔4周后同樣方法免疫第2次；RFP/INH藥物治療組通過飲水治療，持續(xù)12周；各組小鼠在治療結(jié)束4周后，通過肌肉注射地塞米松誘導(dǎo)小鼠MTB感染的復(fù)發(fā)。③觀察并記錄各組小鼠活動及體重變化情況；分別在實驗開始后第8周、13周、17周、22周和26周無菌分離小鼠脾臟，分離脾淋巴細(xì)胞，采用ELISpot檢測分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞頻數(shù)；④分別在第10周、14周、18周、22周和第26周無菌分離小鼠肺、脾組織，進(jìn)行抗酸染色檢查、HE染色觀察及荷菌數(shù)（CFU）檢測。 結(jié)果：①感染小鼠肺和脾中均可見抗酸桿菌（++），HE染色可見慢性炎癥反應(yīng)（無典型慢性肉芽腫性炎的病理表現(xiàn)），肺和脾荷菌數(shù)分別為104CFU和103CFU，表明MTB低劑量感染小鼠模型建立成功；②各組小鼠體重均呈緩慢增長趨勢，各組間無顯著差異（P0.05）；③在各自的免疫治療后的4周和第8周，Ag85B-ESAT-6-rMS組和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS組小鼠分泌IFN-γ的脾淋巴細(xì)胞頻數(shù)均高于感染模型對照組（P0.05）；④治療后各組小鼠肺組織的HE染色觀察均可見輕至中度慢性炎癥反應(yīng)，未見明顯的病理性損傷表現(xiàn)。⑤治療后，Ag85B-ESAT-6-rMS治療組小鼠和RFP/INH+Ag85B-ESAT-6-rMS治療組小鼠的肺、脾荷菌數(shù)均低于感染模型對照組（P0.05），其中聯(lián)合治療組的效果更為顯著；地塞米松誘導(dǎo)后，該兩組小鼠肺、脾荷菌數(shù)雖然上升，，但仍低于感染模型對照組（P0.05）。 【結(jié)論】 本研究成功構(gòu)建了能分泌表達(dá)MTB Ag85B-ESAT-6融合蛋白的Ag85B-ESAT-6-rMS，該菌能夠誘導(dǎo)免疫小鼠以Th1型為主的細(xì)胞免疫應(yīng)答。Ag85B-ESAT-6-rMS能夠抑制MTB耐RFP株在小鼠肺和脾組織中的增殖，對該菌株感染小鼠具有明顯的免疫治療作用，但同時也可引起感染小鼠肺組織一定的病理損傷；將Ag85B-ESAT-6-rMS與INH聯(lián)合應(yīng)用時的治療效果顯著優(yōu)于單獨用rMS治療。Ag85B-ESAT-6-rMS對MTB H37Rv株低劑量感染小鼠也有明顯的免疫治療作用；與RFP和INH聯(lián)合治療的效果要優(yōu)于單獨使用rMS；Ag85B-ESAT-6-rMS對MTB H37Rv株低劑量感染小鼠的免疫治療后，小鼠肺組織未見明顯病理損傷。Ag85B-ESAT-6-rMS作為治療性疫苗有一定的優(yōu)勢，主要針對一些耐藥菌或是殘留于組織和細(xì)胞中低載量的休眠菌引發(fā)免疫清除，利用其可調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)功能，增強機體特異性免疫應(yīng)答的特性，與化療藥物聯(lián)用，發(fā)揮協(xié)同治療作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R52

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1890677