本文選題：干細(xì)胞 + 2型糖尿病�。� 參考：《山東大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：研究背景2型糖尿病(T2DM)是一種慢性炎性疾病,其發(fā)病機(jī)制核心為胰島素抵抗和漸進(jìn)性胰島β細(xì)胞功能衰退,同時還涉及免疫失衡和胰島α細(xì)胞功能亢進(jìn)等其他病理生理過程。而干細(xì)胞因其可分泌多種生長、調(diào)節(jié)因子并具有多向分化潛能的特性,促使多項(xiàng)臨床及基礎(chǔ)研究在干細(xì)胞輸注治療糖尿病領(lǐng)域進(jìn)行了有益的探索。選取何種干細(xì)胞、以達(dá)到最優(yōu)的治療效果,一直是研究者們最為關(guān)注的問題。骨髓造血干細(xì)胞或骨髓單核細(xì)胞輸注已被多項(xiàng)研究證實(shí)對T1DM和T2DM療效確切,可降低血糖并改善胰島功能;但雖然其效果明顯,也具有不可避免的缺點(diǎn):骨髓干細(xì)胞的獲取為有創(chuàng)性操作,且患者自體骨髓造血干細(xì)胞的增殖、分泌能力會因長期處于高糖環(huán)境而受損;但若采用異體骨髓干細(xì)胞輸注,則又面臨著免疫抑制劑的使用及藥物副作用等問題。因此,越來越多的研究者們也將目光投向除骨髓造血干細(xì)胞外的其他種類干細(xì)胞,如免疫原性更低的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、來源更廣的脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞及無創(chuàng)性獲得的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞及臍血單個核細(xì)胞等�，F(xiàn)有的臨床研究顯示,以上幾種干細(xì)胞均可起到一定的平穩(wěn)血糖的作用,但在改善胰島功能方面不同研究之間尚存在一定的不一致性,尤其在改善胰島功能方面。目前為止尚未有研究在同一試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)下比較不同干細(xì)胞對血糖控制及胰島功能的改善作用�？紤]到既往單一干細(xì)胞輸注的臨床研究結(jié)果的不一致性,為了達(dá)到為不同患者制定符合其病情的精準(zhǔn)治療方案、篩選最優(yōu)的干細(xì)胞種類,因此在同一研究標(biāo)準(zhǔn)下比較不同干細(xì)胞輸注的有效性及各自療效側(cè)重就有很大臨床意義。胰島是一種高度血管化的組織,其體積占胰腺總體積的1-2%,但血流量卻占胰腺總血流的10-20%。鑒于此結(jié)構(gòu)的特殊性,胰島可迅速感知血糖及激素變化,但也使其極易遭受氧化應(yīng)激等有害刺激的損傷。一旦胰島微循環(huán)內(nèi)皮的完整性及功能受損,將導(dǎo)致淋巴細(xì)胞的粘附、浸潤增加,從而加劇胰島的破壞:因此,保護(hù)胰島微循環(huán)與保護(hù)胰島β細(xì)胞功能一樣重要。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)已在多項(xiàng)臨床研究及動物試驗(yàn)中被證實(shí)能夠改善糖耐量和胰島功能,但其具體是通過分泌何種因子、激活哪條通路達(dá)到的以上療效,仍少有研究報(bào)道。Wnt蛋白是一類與生長發(fā)育、細(xì)胞增殖遷移與干細(xì)胞干性維持及分化調(diào)節(jié)有關(guān)的重要因子,一般由干細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞等分化程度較低的細(xì)胞分泌,正常狀態(tài)下的成熟細(xì)胞僅表達(dá)少量的Wnt蛋白,但在組織損傷修復(fù)的過程中可一定程度上調(diào)。以細(xì)胞種類不同及作用濃度不同,Wnt蛋白可激活不同的下游通路,即的β-catenin依賴性的經(jīng)典Wnt通路,和β-catenin非依賴性的非經(jīng)典Wnt通路。既往的研究已證實(shí)Wnt通路的激活可促進(jìn)病理/生理性的血管增生,并且在胰島β細(xì)胞中敲除β-catenin或其下游的TCF7L2均可導(dǎo)致胰島功能和形態(tài)學(xué)的異常,進(jìn)而導(dǎo)致糖耐量受損。Wnt3a、Wnt4均可通過激活經(jīng)典β-catenin依賴性Wnt通路促進(jìn)β細(xì)胞增殖,而Wnt4對β細(xì)胞分泌卻沒有明顯影響�；谝陨涎芯拷Y(jié)果,我們合理假設(shè)MSC可以通過分泌Wnt蛋白、激活胰島β細(xì)胞及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞中的β-catenin通路,改善胰島功能和微循環(huán)內(nèi)皮功能。研究目的本研究旨在通過評估大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bmMSC)、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hucMSC)及臍帶血單核細(xì)胞(CBSC)單次或雙次輸注的治療效果,比較每種治療方案對糖尿病鼠血糖狀況、胰島功能、胰島素抵抗和慢性炎癥反應(yīng)的影響,以期探討各種干細(xì)胞的治療側(cè)重,為臨床應(yīng)用的干細(xì)胞選擇提供最優(yōu)方案,為干細(xì)胞個體治療方案的擬定提供依據(jù)。繼而我們通過bmMSC體外與胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1及離體胰島的共培養(yǎng),探討了 MSC分泌的Wnt蛋白和胰島內(nèi)β-catenin依賴的Wnt通路對氧化應(yīng)激損傷下的MS-1和胰島功能的作用。研究方法第一部分不同種類干細(xì)胞靜脈輸注對2型糖尿病大鼠治療效果的比較1、通過高脂高糖飲食+小劑量STZ誘導(dǎo)2型糖尿病SD大鼠模型,每周監(jiān)測血糖,確定造模成功。于造模成功后7天,對T2DM大鼠進(jìn)行隨機(jī)分組:T2DM、T2DM+bmMSC、T2DM+hucMSC、T2DM+CBSC。對于T2DM+hucMSC的部分大鼠,于首次輸注干細(xì)胞后2周進(jìn)行第二次干細(xì)胞治療,輸注HucMSC或CBSC。于第一次干細(xì)胞注射后2w、4w、8w分別進(jìn)行IPGTT并尾尖取血測血糖、胰島素、胰高糖素,三天后處死,留取空腹血及各類臟器。2、比較不同處理組的血糖控制情況:每周檢測1次鼠尾血糖。IPGTT采用腹腔注射葡萄糖1.5g/kg體重,大鼠用異氟烷麻醉,剪尾取血。3、比較不同處理組的胰島功能及形態(tài)學(xué)變化:放免法檢測空腹胰島素/胰高糖素及IPGTT后的胰島素/胰高糖素曲線變化。胰腺石蠟切片HE染色觀察胰島形態(tài)及大小改變。胰腺石蠟免疫組化染色觀察胰島素陽性區(qū)域大小及比例改變。胰腺石蠟免疫熒光染色觀察胰島素(+)/胰高糖素(+)區(qū)域比例及PCNA、胰島素雙陽性細(xì)胞在胰島素陽性細(xì)胞中的比例。4、比較不同處理組的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)改變:HOMA-IR、胰島素敏感性指數(shù)Matsuda index和胰島素敏感性指數(shù)Belfiore index評判大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。同時肝臟Western blotting檢測p-AKT/t-AKT和p-Erk/t-Erk胰島素通路相關(guān)蛋白的表達(dá)趨勢。5、比較不同處理組肝臟糖代謝的改變:提取肝臟蛋白,Western blotting檢測肝糖代謝關(guān)鍵酶糖原合成酶激酶(GSK3)、肝臟糖攝取關(guān)鍵蛋白葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)子2(GLUT2)、糖酵解關(guān)鍵酶丙酮酸激酶(PK)、磷酸果糖激酶(PFK)、丙酮酸脫氫酶激酶(PDK)及糖異生關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(G-6-Pase)、磷酸烯醇丙酮羧基酶-1(PCK1)的表達(dá)量。同時肝臟組織石蠟切片糖原染色,觀察糖原儲存量的改變。6、比較不同處理組的脂代謝的改變:生化法檢測TC、TG、LDL、HDL和FFA。7、比較不同處理組的血清學(xué)代謝指標(biāo)及炎性因子的變化差異:ELISA法檢測IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22、TNF-α 及 IFN-γ。第二部分MSC改善胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究1、通過H2O2刺激構(gòu)建大鼠離體胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1的氧化應(yīng)激損傷,并用Transwell系統(tǒng)將其與bmMSC共培養(yǎng),檢測離體胰島的活性及GSIS胰島素分泌,MS-1的活性、凋亡及eNOS活性等功能學(xué)指標(biāo)。2、qPCR比較大鼠離體胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞MS-1與bmMSC的Wnt蛋白表達(dá)差異,并觀察bmMSC輸注后或Transwell培養(yǎng)后胰島及MS-1中β-catenin依賴性的Wnt通路的激活情況。3、使用XAV-939特異性阻斷胰島或MS-1中的β-catenin,觀察bmMSC共培養(yǎng)對H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷的挽救作用是否被抵消。4、對bmMSC中的Wnt4、Wnt5a分別進(jìn)行敲除,并將敲除后的bmMSC與胰島和MS-1分別共培養(yǎng),觀察Wnt4和Wnt5a敲除對胰島和MS-1氧化應(yīng)激的活性變化、凋亡及胰島素分泌量、eNOS活性等功能學(xué)指標(biāo)的改變。5、將分別敲除Wnt4、Wnt5a后的bmMSC與MS-1分別培養(yǎng),觀察MS-1中的β-catenin依賴性的Wnt通路的激活情況。研究結(jié)果第一部分不同種類干細(xì)胞靜脈輸注對2型糖尿病大鼠治療效果的比較1、T2DM造模成功后SD大鼠血糖明顯升高,但干細(xì)胞輸注后空腹血糖較前明顯下降,該治療效果可維持至輸注后8w。不同干細(xì)胞及不同輸注次數(shù)的組間,空腹血糖水平無明顯差異。IPGTT結(jié)果顯示干細(xì)胞輸注后2w大鼠的餐后血糖并無明顯改善;然而至4w時各組各時點(diǎn)的血糖均較T2DM有明顯下降。8w時,雖然空腹及餐后0.5h干細(xì)胞干預(yù)組仍可保持較好血糖控制,然而除了 hucMSC+CBSC雙次注射組外,其余各組的1-3h血糖均與T2DM組無明顯差別。2、干細(xì)胞輸注可顯著抑制T2DM大鼠升高的空腹胰高糖素,各組間效果無明顯差異。bmMSC或CBSC單獨(dú)輸注均可顯著改善T2DM大鼠的空腹胰島素水平,其他各組對此指標(biāo)的改善不明顯。胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果顯示,干細(xì)胞輸注2w時,bmMSC輸注組的餐后胰島素水平有明顯升高,其他組無明顯改變,但各組釋放曲線形態(tài)均較紊亂;至4w時,各組胰島素釋放曲線明顯規(guī)整,基本均可于餐后3h回落至基線水平,其中bmMSC或CBSC單獨(dú)輸注的餐后胰島素水平均明顯高于T2DM未處理組;8w時,bmMSC輸注組的釋放曲線進(jìn)一步趨近正常,而hucMSC+CBSC雙次注射組表現(xiàn)出明顯的餐后胰島素釋放增多。除bmMSC組外,其他各組均可顯著抑制餐后胰高糖素的分泌。3、干細(xì)胞輸注后2w及4w,干細(xì)胞可顯著保存胰島面積;在保存β細(xì)胞面積方面,bmMSC的效果較明顯。對于改善胰島內(nèi)α、β細(xì)胞比例方面,干細(xì)胞輸注后2w各組均未見明顯改善;4w時,bmMSC表現(xiàn)出較為明顯的β細(xì)胞比例增加,而所有干細(xì)胞輸注組的α細(xì)胞面積均顯著減少,各組間無明顯差異;8w時,所有干細(xì)胞輸注組的α細(xì)胞面積均顯著減少的趨勢持續(xù),而CBSC單次注射及hucMSC+CBSC、hucMSC*2次三組均表現(xiàn)為β細(xì)胞比例明顯增加:提示CBSC單次注射或干細(xì)胞2次注射可將改善β細(xì)胞比例的治療維持更久。4、在干細(xì)胞輸注2w及4w時均可于CBSC單次輸注、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次輸注組中觀察到PCNA陽性的β細(xì)胞明顯增多,提示β細(xì)胞增生。而觀察至8w,增生的情況明顯降低,唯有hucMSC+CBSC仍可觀察到明顯的增生。5、本研究還觀察到CBSC組部分胰島細(xì)胞出現(xiàn)胰島素與胰高糖素共染的情況,但該現(xiàn)象并未在其他組中出現(xiàn),提示CBSC可能促進(jìn)了 α向β細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。6、經(jīng)過胰島素敏感性指數(shù)及肝臟胰島素通路相關(guān)蛋白表達(dá)的雙重印證,bmMSC單次輸注、hucMSC單次輸注及hucMSC先后兩次輸注可顯著改善T2DM大鼠的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。7、空腹的T2DM大鼠肝臟中存在糖原合成減少、糖酵解受抑、糖異生增加及胰島素抵抗;而干細(xì)胞的輸注可選擇性地作用于其中不同的關(guān)鍵酶,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用:在改善肝糖原合成方面,本文涉及的所有干細(xì)胞輸注方案均有效果;改善葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)方面,bmMSC與hucMSC單次輸注效果明顯;bmMSC與hucMSC單次輸注亦可促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生并改善空腹肝臟胰島素抵抗。輸注多次干細(xì)胞的兩組對肝臟的作用則更多體現(xiàn)在抑制糖異生及改善胰島素抵抗方面。8、除CBSC單次輸注組可觀察到明顯TC、TG下降外,其他各組對血脂指標(biāo)的改善不明顯。9、hucMSC+CBSC及hucMSC*2次輸注可明顯改善各項(xiàng)炎癥相關(guān)免疫指標(biāo),如IL-1b、IL-6、IL-17、IL-22 及 IFN-g。第二部分MSC改善胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞功能的機(jī)制研究1、bmmMSC與MS-1細(xì)胞共培養(yǎng)可顯著改善H202所致的凋亡、eNOS活性降低及VCAM升高;同時也可改善氧化應(yīng)激損傷后離體胰島的活性下降及高糖刺激下的胰島素分泌障礙。2、bmMSC較離體胰島和MS-1細(xì)胞可表達(dá)顯著增高的Wnt4和Wnt5a。bmMSC靜脈輸注的T2DM大鼠胰島中存在β細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的β-catenin核轉(zhuǎn)位,同時與MSC共培養(yǎng)后的MS-1也存在β-catenin核轉(zhuǎn)位增加,提示MSC可激活β細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞中的經(jīng)典Wnt通路。3、用XAV-939處理胰島及MS-1后,bmMSC的上述改善作用顯著降低,提示干細(xì)胞的有益作用可能由激活經(jīng)典Wnt通路介導(dǎo)。4、在MSC中分別沉默Wnt4、Wnt5a后再與H202刺激的MS-1/離體胰島共培養(yǎng),結(jié)果顯示W(wǎng)nt4沉默可顯著降低MSC對上兩者的改善作用:說明MSC分泌的Wnt4可能是介導(dǎo)其對氧化應(yīng)激胰島及內(nèi)皮細(xì)胞挽救作用的關(guān)鍵因子之一。5、在MSC中沉默Wnt4后MS-1細(xì)胞中經(jīng)典Wnt通路激活減弱,提示MSC分泌的Wnt4可通過激活經(jīng)典Wnt通路,改善胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞的存活及功能。研究結(jié)論在我們的研究中,首次對比了骨髓、臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞及臍血干細(xì)胞,輸注一次或兩次對T2DM大鼠模型胰島功能和糖代謝的改善效果,首次觀察了干細(xì)胞輸注對胰島α細(xì)胞功能和比例的影響,并觀察了干細(xì)胞對IL-22的作用。1、所有干細(xì)胞在降低T2DM空腹血糖方面效力等同,但在平穩(wěn)餐后血糖方面唯有hucMSC+CBSC的治療組可將有效性持續(xù)至輸注后8w。2、bmMSC和CBSC組改善空腹胰島素作用明顯,bmMSC和hucMSC+CBSC先后注射組改善糖負(fù)荷后胰島素分泌的作用可持續(xù)至8w。3、CBSC單次注射或干細(xì)胞2次注射(T2DM+hucMSCCBSC組及T2DM+hucMSC*2組)可將改善β細(xì)胞比例的治療維持更久,可能與維持持續(xù)性的β細(xì)胞增生有關(guān)。4、各種干細(xì)胞輸注均可明顯抑制胰高糖素空腹及餐后的分泌,并抑制α細(xì)胞的增生。5、bmMSC單次輸注、hucMSC單次輸注及hucMSC先后兩次輸注均可顯著改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。6、本文涉及的所有干細(xì)胞輸注方案均可改善肝糖原合成;bmMSC與hucMSC單次輸注可顯著改善肝臟葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn),亦可促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生;hucMSC雙次輸注可促進(jìn)糖酵解、抑制糖異生。7、CBSC單次輸注可明顯降低TC、TG。8、雙次注射干細(xì)胞組可明顯改善體內(nèi)炎癥狀態(tài)、降低血清IL-1 β、IL-6、IL-17、IL-22及IFN-γ的水平。9、干細(xì)胞輸注后的胰島內(nèi)分泌部及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞均存在不同程度的經(jīng)典Wnt通路激活。10、bmMSC可通過分泌Wnt4,激活離體胰島及胰島微循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞中的β-catenin依賴性的經(jīng)典Wnt通路,改善胰島功能、減少氧化應(yīng)激所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂和凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳同度,張昌穎;素食大鼠的貧血現(xiàn)象[J];營養(yǎng)學(xué)報(bào);1957年04期

2 陳偉強(qiáng);趙善廣;;自制注射用大鼠固定裝置[J];上海實(shí)驗(yàn)動物科學(xué);1992年04期

3 肖柳英,林培英,馮昭明,張丹;不同周齡的SD大鼠生理、生化及體重的正常值測定[J];中藥新藥與臨床藥理;1996年03期

4 李淑云;簡易大鼠灌胃器的制作[J];錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2001年04期

5 楊明智,陳積圣;一種大鼠抓取與固定的新工具介紹[J];上海實(shí)驗(yàn)動物科學(xué);2001年03期

6 戴英,陸群;復(fù)方H_(505)對Wistar大鼠外周血的血液流變學(xué)指標(biāo)的影響[J];中國血液流變學(xué)雜志;2001年01期

7 韋應(yīng)波,孫喜慶,曹新生,姚永杰,馮岱雅,楊長斌;+Gz暴露時間對大鼠記憶功能和行為的影響[J];航天醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)工程;2003年01期

8 呂學(xué)軍,郭俊生,李敏,周利梅,張永娟;暈船大鼠體內(nèi)鐵含量的變化[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2003年04期

9 湯仁仙,王迎偉,王慧,周峰;201A中藥合劑對大鼠抗腎小球基底膜腎炎病變的影響[J];徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年06期

10 孫同柱,付小兵,翁立新,梁雪梅,陳偉;介紹一種簡易的大鼠保定方法[J];上海實(shí)驗(yàn)動物科學(xué);2004年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 尹音;孫振宇;胡敏;李冬霞;;持續(xù)性高正加速度對大鼠顳頜關(guān)節(jié)損傷的作用[A];第八屆全國顳下頜關(guān)節(jié)病學(xué)及（牙合）學(xué)大會論文匯編[C];2011年

2 祝~=驤;iJ梊霞;洃克琴;崔素英;文允摪;，

本文編號：1890162