發(fā)布時(shí)間：2018-04-20 15:01

  本文選題：microRNA + 心肌缺血�。� 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：心力衰竭(心衰)是大多數(shù)心血管疾病的最終歸宿。心衰病因中以高血壓和冠心病最為常見。心肌損傷是心衰的主要病理生理學(xué)機(jī)制,其分子生物學(xué)機(jī)制十分復(fù)雜。近年來,microRNA及肥大細(xì)胞在心肌損傷中的作用受到廣泛關(guān)注,有望為心肌損傷提供新的分子治療靶向。本文對(duì)microRNA-497及組胺H2受體(H2R)在心肌損傷中的作用和機(jī)制進(jìn)行了研究,現(xiàn)分別論述如下： 第一部分：抑制microRNA-497通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡和自噬改善心肌缺血再灌注損傷研究背景與目的 對(duì)于急性心肌梗死的病人而言,挽救缺血心肌最根本而有效的的方法是迅速恢復(fù)血流供應(yīng),即再灌注。再灌注能夠在一定程度上有效的挽救受損心肌,改善心肌缺血、壞死,但是它同樣也會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,使心功能受損,即缺血再灌注(I/R)損傷。然而再灌注損傷的具體機(jī)制并不完全清楚。 MicroRNA(miRNA或miR)是一類內(nèi)源性單鏈非編碼的小RNA。它通過和特定mRNA的3’端非編碼區(qū)完全或不完全互補(bǔ),抑制或降解靶向mRNA而發(fā)揮效應(yīng)。單個(gè)miRNA能夠作用多個(gè)mRNA從而調(diào)控復(fù)雜的病理和生理過程。越來越多的研究證實(shí)一些miRNA在心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用,提示miRNA可能成為缺血再灌注損傷新的治療靶點(diǎn)。 最近的研究發(fā)現(xiàn)miRNA-15(miR-15)家族在心肌缺血和心力衰竭中發(fā)揮重要作用。MiR-15家族主要有6個(gè)成員：miR-15a、miR-15b、miR-16、miR-195、 miR-424和miR-497,它們有著相同的5’端種子序列,因此可能有著類似的調(diào)控作用。心梗小鼠注射抑制miR-15的化學(xué)試劑能夠減少心肌梗死面積；抑制miR-15a或者miR-16能夠促進(jìn)缺血心肌的血管新生；miR-195能夠促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。但是對(duì)這一家族中的miR-497研究甚少,其在心血管疾病中的作用仍不清楚。我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)抗凋亡基因Bcl-2和自噬相關(guān)基因LC3B是miR-497的預(yù)測(cè)靶基因,而這兩種基因被公認(rèn)為參與了缺血再灌注損傷過程。上述研究分析提示著miR-497可能在心肌缺血和心力衰竭中發(fā)揮重要作用。本課題旨在揭示miR-497在心肌缺血再灌損傷中的調(diào)節(jié)作用及其調(diào)控機(jī)制,為臨床治療缺血再灌注損傷提供新的治療靶點(diǎn)。 研究方法 1.心肌缺血和缺血再灌注損傷模型的建立和處理 8-10周齡的C57BL/6雄性小鼠,體重約20-25g,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。經(jīng)胸骨左側(cè)第四肋間開胸,暴露心臟。以8-0尼龍帶針線穿過左心耳下緣1-2mm處的2/3心肌層,短暫結(jié)扎或永久結(jié)扎左側(cè)冠狀動(dòng)脈(以心電圖ST段抬高和心肌變白為標(biāo)志),其中短暫結(jié)扎的動(dòng)物在誘導(dǎo)心肌缺血45min后解除結(jié)扎使其再灌注24h,而永久結(jié)扎的的動(dòng)物則承受心肌缺血24h。缺血再灌注實(shí)驗(yàn)分為6組,每組6只,組別為：(1) Sham組；(2)I/R組；(3)Sham+Ad-GFP組；(4) Sham+Ad-miR-497-sponge組；(5)I/R+Ad-GFP組和(6) I/R+Ad-miR-497-sponge組。腺病毒(對(duì)照病毒Ad-GFP/vector和敲低miR-497的病毒Ad-miR-497-sponge/sponge)分別于缺血再灌注術(shù)前3d心肌直接注射(于心前區(qū)、心尖和心后區(qū)三點(diǎn)各注射25ul),術(shù)后24h處死小鼠,提取心臟,分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫印跡和TTC染色。用于基因和蛋白分析的小鼠心臟保存于-80℃；用于TTC染色的小鼠心臟先冷凍于-20℃15min,取出后均勻切成5片用2%TTC染色進(jìn)行心梗面積分析。 2.細(xì)胞分離培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 原代分離培養(yǎng)SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞,利用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法,將雙鏈成熟miR-497(miR-497mimic)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-497,36h后收集細(xì)胞檢測(cè)miR-497的水平,評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率,并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)�；蛘邔⒁种苖iR-497的腺病毒(Ad-miR-497-sponge)直接轉(zhuǎn)染細(xì)胞,48h后觀察細(xì)胞表達(dá)的GFP熒光,評(píng)價(jià)病毒轉(zhuǎn)染效率,并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。 3.缺氧或缺氧復(fù)氧刺激心肌細(xì)胞 通過建立缺氧和缺氧復(fù)氧(A/R)細(xì)胞模型來分析miR-497對(duì)心肌細(xì)胞的作用。實(shí)驗(yàn)分組如下：(1)對(duì)照組：心肌細(xì)胞置于常氧環(huán)境;(2)缺氧組：心肌細(xì)胞分別置于厭氧環(huán)境3h、6h或24h和(3)A/R組：心肌細(xì)胞分別置于厭氧環(huán)境3h、6h或24h,隨后復(fù)氧2h。缺氧或缺氧復(fù)氧結(jié)束后,用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞miR-497含量。后期實(shí)驗(yàn)選取缺氧3h/復(fù)氧2h (A3h/R2h)作為刺激條件。細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-497mimic36h或腺病毒Ad-miR-497-sponge轉(zhuǎn)染48h后,進(jìn)行缺氧復(fù)氧刺激,隨后細(xì)胞用于蛋白檢測(cè)或者檢測(cè)細(xì)胞凋亡和自噬水平。 4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)microRNA含量 提取細(xì)胞或組織總RNA后,10ng RNA用microRNA專用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(All-in-One TM miRNA Q-PCR Detection Kit)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,然后用特異性引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-497表達(dá)水平,U6作為內(nèi)參。 5.細(xì)胞凋亡和自噬檢測(cè) 分離原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞種于P3.5cm的小皿,待進(jìn)行相應(yīng)刺激處理后,分別經(jīng)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶dUTP切口末端標(biāo)記法(TUNEL)和Hoechst染色標(biāo)記細(xì)胞凋亡。單丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)是標(biāo)記自噬體的熒光染料。50nmol/L MDC孵育細(xì)胞10min后4%多聚甲醛固定,用共聚焦顯微鏡觀察自噬小體形成。 結(jié)果 1.心肌缺血和心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧刺激時(shí)miR-497及其預(yù)測(cè)靶蛋白的表達(dá) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)正常成年C57BL/6雄性小鼠各臟器(心臟、肺、腦、腎臟和肝臟)組織內(nèi)miR-497的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)miR-497在心肌組織里高表達(dá)。心梗1d小鼠心肌內(nèi)miR-497表達(dá)開始下降。隨著心肌缺血時(shí)間的延長(zhǎng),miR-497的表達(dá)進(jìn)一步下降。在心肌細(xì)胞單純?nèi)毖?h或6h,miR-497的表達(dá)沒有變化,直至24h才開始下降(常氧組：miR-497/U6為0.813；缺氧24h：miR-497/U6為0.459,P0.01)。而心肌細(xì)胞在缺氧復(fù)氧刺激下,miR-497在缺氧3h/復(fù)氧2h就開始顯著下降(P0.01),隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),miR-497的表達(dá)進(jìn)一步下降。上面的結(jié)果提示miR-497可能參與了心肌缺血或缺氧病理生理過程,且與心肌缺血再灌注損傷更相關(guān)。因?yàn)閙iR-497在缺氧3h/復(fù)氧2h(A3h/R2h)即開始顯著的下降,因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選取A3h/R2h作為刺激條件。 利用數(shù)據(jù)庫TargetScanHuman6.2和miRanda對(duì)miR-497的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),挑選軟件交集及預(yù)測(cè)值高的靶點(diǎn),選取抗凋亡基因Bcl-2和自噬相關(guān)基因LC3B作為研究對(duì)象。利用western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心梗2w和4w心肌組織中Bcl-2和LC3B蛋白的表達(dá)水平均較假手術(shù)組顯著上調(diào)(P0.05)。同樣,心肌細(xì)胞接受A3h/R2h刺激后,Bcl-2和LC3B蛋白的表達(dá)水平也顯著上調(diào)(P0.05)。 2.過表達(dá)miR-497對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和自噬的影響 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染50nM miR-497mimic36h后,real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞中miR-497的表達(dá)顯著升高(P0.01)。利用Hoechst染色和TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞miR-497過表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示單純A3h/R2h刺激和50nM的miR-497轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞均能顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡(P0.01)。缺氧復(fù)氧刺激前過表達(dá)miR-497引起的凋亡心肌細(xì)胞數(shù)目較單純進(jìn)行缺氧復(fù)氧刺激更多(vs. A3h/R2h group, P0.05)。用單丹磺酰尸胺(Monodansylcadaverine,MDC)標(biāo)記自噬體,熒光染色結(jié)果顯示單純A3h/R2h刺激乳鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬體形成；而乳鼠心肌細(xì)胞單純過表達(dá)miR-497自噬體并沒有明顯增加。相反,在進(jìn)行缺氧復(fù)氧刺激前過表達(dá)miR-497能減少缺氧復(fù)氧刺激誘導(dǎo)形成的自噬體。結(jié)合上面的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧刺激誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡和自噬體形成,而過表達(dá)miR-497預(yù)處理時(shí),細(xì)胞自噬體的形成減少而凋亡的細(xì)胞數(shù)目進(jìn)一步增加,細(xì)胞活性進(jìn)一步降低。 3.抑制miR-497表達(dá)減輕缺氧復(fù)氧刺激對(duì)心肌細(xì)胞的損傷 心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-miR-497-sponge (MOI=10)48h后,用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白GFP的表達(dá),可見90%以上的心肌細(xì)胞表達(dá)GFP。同樣利用Hoechst染色和TUNEL法檢測(cè)抑制心肌細(xì)胞miR-497表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響,結(jié)果顯示A3h/R2h刺激顯著誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的凋亡(vs. normoxia+control group,P0.01),而單獨(dú)轉(zhuǎn)染Ad-miR-497-sponge對(duì)心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目沒有影響。在進(jìn)行缺氧復(fù)氧刺激前抑制miR-497,結(jié)果顯示心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目較單純進(jìn)行缺氧復(fù)氧刺激減少(vs. A3h/R2h group, P0.05)。MDC熒光染色結(jié)果顯示單純A3h/R2h刺激乳鼠心肌細(xì)胞誘導(dǎo)心肌細(xì)胞自噬體形成；在進(jìn)行缺氧復(fù)氧刺激前抑制miR-497心肌細(xì)胞能進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬體的產(chǎn)生。上面的結(jié)果顯示抑制心肌細(xì)胞miR-497表達(dá)能夠減輕缺氧復(fù)氧所致的損傷。 4.MiR-497調(diào)節(jié)其靶蛋白Bcl-2和LC3B的表達(dá) 心肌細(xì)胞過表達(dá)miR-497,western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)Bcl-2和LC3B蛋白表達(dá)水平下降；相反,抑制心肌細(xì)胞miR-497的表達(dá),則Bcl-2和LC3B蛋白表達(dá)水平相應(yīng)升高。提示缺氧復(fù)氧刺激心肌細(xì)胞導(dǎo)致miR-497表達(dá)水平降低可能通過其靶蛋白Bcl-2和LC3B起到作用。 5.心肌注射Ad-miR-497-sponge能夠減少心梗面積直接心肌注射腺病毒Ad-miR-497-sponge3d后制備心肌缺血再灌注模型,real time PCR檢測(cè)心肌miR-497表達(dá),結(jié)果顯示miR-497表達(dá)在單純?nèi)毖?5min再灌注24h的I/R組較假手術(shù)組顯著下降(0.30±0.03vs.1.00±0.00,P0.01)。在心肌注射Ad-miR-497-sponge的假手術(shù)組,心肌中miR-497表達(dá)下降,而心肌注射Ad-miR-497-sponge的I/R組miR-497水平進(jìn)一步下降(vs.I/R+Vector:0.16±0.01vs.0.31±0.03,P0.05)。用TTC染色檢測(cè)心梗面積顯示,心肌注射腺病毒Ad-miR-497-sponge的I/R組較對(duì)照病毒組明顯減小(24.35±2.46%vs.36.12±2.88%,P0.05)。 結(jié)論 1.心肌缺血和心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧刺激時(shí),miR-497表達(dá)水平明顯下調(diào),而其預(yù)測(cè)靶基因Bcl-2和LC3B蛋白表達(dá)水平相應(yīng)上調(diào),提示miR-497在缺血再灌注損傷時(shí)可能起著重要作用。 2.MiR-497可能通過靶基因Bcl-2和LC3B調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡和自噬。 3.抑制心肌miR-497表達(dá)能夠減少心肌缺血再灌注損傷心梗面積,提示抑制miR-497可以作為心肌缺血再灌注損傷的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)。 第二部分：阻斷組胺H2受體通過減輕心肌凋亡和纖維化延緩心力衰竭進(jìn)程 研究背景與目的 肥大細(xì)胞參與了各種心血管疾病如缺血再灌注損傷、心律失常、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病所致的心血管并發(fā)癥和心臟移植等的病理生理過程,在心肌肥厚和慢性心力衰竭中發(fā)揮著重要的作用。眾所周知,肥大細(xì)胞脫顆粒能釋放組胺。而在心肌組織中表達(dá)的組胺H2受體(Histamine2receptor, H2R),屬于G蛋白偶聯(lián)受體。G蛋白偶聯(lián)受體激活能夠進(jìn)一步觸發(fā)胞內(nèi)多種信號(hào)分子,進(jìn)而影響心功能。有研究報(bào)道H2R的阻斷劑對(duì)慢性心力衰竭患者有利,但是具體的保護(hù)機(jī)制卻并不是十分清楚。我們都知道細(xì)胞凋亡和心肌纖維化在心力衰竭發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中起到至關(guān)重要的作用。我們以前的研究證實(shí)心肌缺血再灌注損傷時(shí)H2R被激活,激活的H2R能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡。而這可能也是H2R參與慢性心力衰竭的機(jī)制之一。雖然目前還沒有研究明確表明心肌纖維化過程中H2R被激活,但是有報(bào)道肥大細(xì)胞分泌的組胺和腎素能夠促進(jìn)肺組織纖維化。另外組胺對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的纖維化具有促進(jìn)作用,而鈣調(diào)磷酸酶也參與了血管緊張素Ⅱ介導(dǎo)的心肌纖維化。并且鈣依賴性的鈣調(diào)磷酸酶信號(hào)通路在心力衰竭中發(fā)揮重要作用。那么H2R激活是否與鈣調(diào)磷酸酶具有關(guān)聯(lián)呢? 雖然已經(jīng)有一些臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證明藥物阻斷H2R能夠改善心力衰竭,但是目前還沒有研究應(yīng)用H2R基因敲除動(dòng)物來證實(shí)這一效應(yīng),并且心肌纖維化和細(xì)胞凋亡是否參與這一過程也不明確。本課題旨在揭示H2R基因敲除對(duì)壓力負(fù)荷誘導(dǎo)的心力衰竭的調(diào)節(jié)作用,以及它對(duì)心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化的調(diào)節(jié)機(jī)制的探討。 研究方法 1.小鼠壓力負(fù)荷模型的建立 7-8周齡的組胺H2受體基因敲除(Knockout, KO)和野生型(Wildtype, WT)雄性小鼠,甲苯噻嗪(5mg/kg)和氯胺酮(100mg/kg)混合腹腔注射麻醉。經(jīng)胸骨左側(cè)第二肋間開胸,進(jìn)入胸腔后撥開胸腺充分暴露主動(dòng)脈弓。分離主動(dòng)脈弓周圍結(jié)締組織,用7-0絲線穿過主動(dòng)脈弓,其上放置一枚27號(hào)彎針,將該針與主動(dòng)脈弓一起用力結(jié)扎,隨后立即撤針,假手術(shù)組小鼠只過線不結(jié)扎。用5-0線關(guān)胸,小鼠蘇醒后放回鼠籠。實(shí)驗(yàn)分為4組,組別為：(1)WT-Sham組;(2) WT-TAC組；(3) KO-Sham組和(4) KO-TAC組。手術(shù)4w時(shí),超聲和左室血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)小鼠心功能,隨后處死小鼠,提取心臟和肺組織,用于后續(xù)試驗(yàn)。用于基因和蛋白分析的小鼠心臟保存于-80℃,用于組織學(xué)分析的用10%甲醛固定。 2.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能 TAC4w的小鼠麻醉固定后,采用連接17L5高頻探頭的西門子超聲儀進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)。二維超聲顯示左室短軸切面,應(yīng)用M超模式記錄左心室運(yùn)動(dòng)情況,測(cè)量左室舒張末后壁厚度(LVPWd)、舒張末內(nèi)徑(LVEDd)和收縮末內(nèi)徑(LVESd)等參數(shù),按照如下公式計(jì)算左室短軸縮短率：]LVFS%=(LVEDd-LVESd)/LVEDd×100。 3.創(chuàng)傷性血流動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè) TAC4w的小鼠麻醉固定后,Millar導(dǎo)管經(jīng)右頸總動(dòng)脈慢慢引入左心室,連接PowerLab系統(tǒng),測(cè)量左室收縮壓(LVSP)、舒張末壓(LVEDP)、計(jì)算左室內(nèi)壓最大上升和下降速率(max dpldt和min dp/dt)以及收縮指數(shù)和Tau指數(shù)。 4.組織學(xué)檢測(cè) 心臟組織經(jīng)10%甲醛固定、脫水、石蠟包埋、切片后,進(jìn)行Masson三色染色觀察纖維化情況。 甲苯胺藍(lán)常用于染心肌肥大細(xì)胞。心肌組織石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化后,浸泡于0.05%甲苯胺藍(lán)染色30min。封片后在高倍鏡下觀察肥大細(xì)胞數(shù)目。 5.成纖維細(xì)胞增殖檢測(cè) 原代分離SD大鼠乳鼠成纖維細(xì)胞傳代種于96孔板培養(yǎng)24h后,分別加入慢病毒(pLVX-shRNA-calcinuerin, Lv-CN或pLVX,Lv-NC)刺激48h后,繼續(xù)加入組胺H2受體特異性激動(dòng)劑AD (amthamine dihydrobromide)刺激24h。實(shí)驗(yàn)分為6組：對(duì)照(Con)組、AD組、Lv-NC組、Lv-NC+AD組、Lv-CN組和Lv-CN+AD組。處理完后每孔加入10u1的CCK8置于37℃孵箱里培養(yǎng)4h。分光光度計(jì)450nm檢測(cè)每組的吸光度。 6.線粒體膜電位檢測(cè) 原代分離SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞刺激處理完后分別加入1.0mM的鈣黃綠素和25nM的氧化型線粒體探針(MitoTracker)孵育,熒光顯微鏡下觀察兩種熒光的強(qiáng)度。四甲基羅丹明乙酯(TMRE)是一種帶正電荷的染料。當(dāng)線粒體通透性增加致使膜電位下降時(shí),TMRE不再積聚,線粒體熒光值下降。50nM的TMRE室溫孵育細(xì)胞30min,熒光顯微鏡下觀察TMRE熒光強(qiáng)度。 結(jié)果 1.H2R基因敲除減輕壓力負(fù)荷所致的心功能紊亂 我們發(fā)現(xiàn)TAC4w的野生型小鼠心肌組織中H2R蛋白的表達(dá)升高,肥大細(xì)胞數(shù)目也增加,提示H2R可能參與了壓力負(fù)荷誘導(dǎo)心力衰竭這一病理過程。同時(shí)我們將H2R基因敲除小鼠制備TAC模型。血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示在TAC4w時(shí),WT小鼠心衰程度更重,導(dǎo)致左室收縮壓LVSP降低。與WT TAC小鼠相比,KO小鼠左室舒張末壓LVEDP更低、收縮指數(shù)更大,提示H2R基因敲除小鼠舒張和收縮功能都有所改善。超聲結(jié)果顯示,與WT小鼠相比,KO小鼠收縮末內(nèi)徑LVESd更小而左室短軸縮短率LVFS更大,也提示H2R基因敲除的小鼠心臟重構(gòu)減輕。 2.壓力負(fù)荷模型所致的形態(tài)學(xué)改變 對(duì)H2R基因敲除小鼠和野生型小鼠分別進(jìn)行TAC手術(shù),維持4w。稱取各組小鼠的心臟和肺組織,計(jì)算肺重體重比和心重體重比。KO組的肺重體重比較WT組輕,但是兩組的心重體重比卻沒有顯著差異。Masson染色顯示兩組心肌細(xì)胞面積沒有差異,但是KO組的纖維化程度減輕。綜合上面的結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)敲除H2R能夠減輕壓力負(fù)荷所致的肺淤血和心肌纖維化。 3.阻斷H2R抑制心肌成纖維細(xì)胞calcineurin的表達(dá) 眾所周知,calcineurin是促心肌肥厚的因子。我們發(fā)現(xiàn)在TAC4w野生型小鼠心肌組織中calcinuerin蛋白表達(dá)升高,而在H2R基因敲除小鼠心肌中升高的程度要小。這與前面我們觀察到的兩組小鼠心肌細(xì)胞面積沒有差異這一結(jié)果看似矛盾。為了尋找其中的原因,我們分離原代SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。首先我們檢測(cè)到心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞均表達(dá)H2R蛋白。而用組胺刺激兩種細(xì)胞發(fā)現(xiàn),只有成纖維細(xì)胞中calcinuerin的表達(dá)升高,心肌細(xì)胞中calcinuerin的表達(dá)沒有變化。進(jìn)一步用H2R激動(dòng)劑AD刺激成纖維細(xì)胞24h,檢測(cè)到calcinuerin的表達(dá)升高并且H2R特異性阻斷劑法莫替丁(famotidine,Fam)能夠阻斷這一作用。 4.Calcineurin介導(dǎo)成纖維細(xì)胞組胺H2受體激活誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖 我們構(gòu)建calcinuerin敲低的慢病毒shRNA-calcineurin,并且能夠有效的抑制成纖維細(xì)胞中calcinuerin的表達(dá)。通過CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況發(fā)現(xiàn),H2R激動(dòng)劑AD能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,而慢病毒shRNA-calcineurin能夠阻斷這一效應(yīng),說明calcinuerin參與了H2R激活促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖這一過程。 5.H2R激活對(duì)成纖維細(xì)胞calcinuerin/NFAT通路的影響 我們用H2R激動(dòng)劑AD刺激成纖維細(xì)胞,通過western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)它能夠顯著誘導(dǎo)NFATc3核轉(zhuǎn)位以及胞外基質(zhì)蛋白fibronectin和a-SMA表達(dá)的增加；通過realtime PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)它能夠使procollagen I和Ⅲ基因水平也升高。而加入shRNA-calcineurin慢病毒,除了不能使升高的a-SMA蛋白水平下降,它可以阻斷AD誘導(dǎo)的其他蛋白和基因的變化。 6.阻斷H2R對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響 H2R基因敲除小鼠和野生型小鼠分別進(jìn)行TAC手術(shù),維持4w。通過TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡的情況,發(fā)現(xiàn)TAC組小鼠心肌組織凋亡細(xì)胞的數(shù)目較假手術(shù)組的顯著增加,而相應(yīng)KO TAC小鼠心肌中凋亡的細(xì)胞要少于WT TAC小鼠。同時(shí)檢測(cè)心肌組織中凋亡相關(guān)蛋白Bax和cleavage caspase3的表達(dá),同樣發(fā)現(xiàn)TAC能夠顯著的誘導(dǎo)兩種蛋白的表達(dá),而相應(yīng)地KO小鼠心肌中兩種蛋白的表達(dá)要顯著低于WT小鼠。 7.H2R激活使心肌細(xì)胞線粒體通透性增加,促進(jìn)細(xì)胞凋亡 我們用鈣黃綠素和Mito Tracker標(biāo)記心肌細(xì)胞的線粒體。染色結(jié)果顯示組胺和H2R特異性激動(dòng)劑AD均能使分子探針的熒光強(qiáng)度減弱,表明H2R激活使線粒體通透性增強(qiáng)。而H2R特異性拮抗劑Fam和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔抑制劑CSA都能拮抗這一作用。另外用四甲基羅丹明乙酯TRME染色檢測(cè)線粒體膜電位。我們發(fā)現(xiàn)AD能夠顯著的降低心肌細(xì)胞]TRME的熒光值,而Fam和CSA均能減弱這一作用。進(jìn)一步我們用組胺刺激心肌細(xì)胞24h,檢測(cè)總蛋白中促凋亡蛋白Bax和cleavage caspase3的表達(dá)升高,而用Fam預(yù)處理細(xì)胞能夠減輕這一作用。而用H2R特異性激動(dòng)劑AD刺激心肌細(xì)胞能夠誘導(dǎo)Bax線粒體轉(zhuǎn)位,同樣的Fam也能夠抑制AD誘導(dǎo)的Bax線粒體轉(zhuǎn)位。用TUNEL和Hoechst染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡,發(fā)現(xiàn)組胺和AD均能誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,而Fam能阻斷這一作用。 結(jié)論 1.小鼠H2R基因敲除能夠抑制壓力負(fù)荷所致的心肌纖維化和細(xì)胞凋亡,延緩心力衰竭進(jìn)程。 2.組胺H2受體激活通過calcinuerin/NFAT通路促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,胞外基質(zhì)蛋白fibronectin和procollagen I及Ⅲ基因表達(dá)的升高。 3.組胺H2受體激活能夠使心肌細(xì)胞線粒體通透性增加,促凋亡蛋白Bax線粒體轉(zhuǎn)位和cleavage caspase3表達(dá)增加,從而促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R541.6

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1778246