發(fā)布時間：2018-04-18 23:12

  本文選題：聯(lián)氨基姜黃素 + 姜黃素�。� 參考：《河北醫(yī)科大學》2014年博士論文

【摘要】：肝細胞性肝癌位居世界惡性腫瘤發(fā)病率的第五位，是全球第三位的癌癥死亡原因。我國是全球肝癌發(fā)病率最高的國家，肝癌為我國第二位惡性腫瘤致死病因。由于該病起病隱匿、進展迅速、早期就診率低，60%-70%的患者在確診時已處于腫瘤晚期，喪失了手術治療的機會，只能進行姑息性的對癥支持治療。至今腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切機制仍不清楚，而且無法在臨床上采取有效的治療措施，因此，揭示惡性腫瘤轉(zhuǎn)移及其調(diào)控的確切分子機制已成為臨床提高腫瘤治療效果的迫切需要。 聯(lián)氨基姜黃素是姜黃素的一種衍生物，同姜黃素相比，聯(lián)氨基姜黃素有更強的水溶性和穩(wěn)定性，具有較高的細胞通透性、抗腫瘤活性、藥理活性較好的生物利用度。JAKs/STATs信號轉(zhuǎn)導通路的持續(xù)活化與腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關。STAT3作為JAKs/STATs轉(zhuǎn)導通路的重要成員，是聯(lián)系胞外信號與細胞應答的橋梁。STAT3參與調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、生存、轉(zhuǎn)移、血管生成、免疫應答等過程。JAK2/STAT3信號通路的激活，特別是STAT3的激活對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著重要影響。本研究采用分子生物學技術和病理學對聯(lián)氨基姜黃素進行研究，探討其體內(nèi)外抗肝癌作用和其作用機制，為最終應用于臨床奠定理論和實驗基礎。 第一部分聯(lián)氨基姜黃素抑制人肝癌細胞HepG2增殖和促進其凋亡 目的：本部分通過觀察姜黃素衍生物——聯(lián)氨基姜黃素（HZC）對人肝癌細胞HepG2增殖和凋亡的影響，探討HZC抑制HepG2細胞增殖的機制。 方法：將HepG2細胞用不同濃度的CUR(10、20、40μmol/L)和HZC(10、20、40μmol/L)分別孵育12、24及48h后進行MTT檢測。本實驗進一步研究HZC和CUR抑制HepG2細胞的誘導凋亡作用，用含有不同濃度CUR(10、20、40μmol/L)和HZC(10、20、40μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞48h，利用流式細胞法測定細胞凋亡率。以不相同濃度CUR和HZC(10、20、40μmol/L)分別刺激肝癌細胞株HepG224h，通過Western blot檢測Bcl-2蛋白家族蛋白表達情況。 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示CUR和HZC對肝癌細胞株HepG2的半抑制濃度（IC50）分別為25.43±2.86μmol/L和5.84±0.97μmol/L。CUR和HZC均可抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，且呈時間、濃度依賴性（P＜0.05）。相同的濃度（40μmol/L）的CUR和HZC作用于HepG2細胞的不同時間（12、24及48h），HZC對HepG2細胞的抑制率均高于CUR（P＜0.05）。流式細胞法測定結(jié)果顯示，同對照組相比，不同濃度的HZC和CUR處理組凋亡率增加，且HZC更為顯著。當CUR和HZC處理濃度為40μmol/L，細胞凋亡水平最高，HZC更為顯著。CUR和HZC均可抑制HepG2細胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表達，并可上調(diào)Bax蛋白的表達，且呈濃度相關性（P＜0.05）。其中對Bcl-2和Bcl-xl蛋白表達的抑制作用和對Bax蛋白表達的促進作用HZC均強于CUR（P＜0.05）。 結(jié)論：CUR和HZC均可抑制人肝癌細胞HepG2的增殖和誘導HepG2細胞凋亡，其中HZC的抑制增殖作用和誘導凋亡作用均強于CUR。HZC對Bcl-2蛋白家族蛋白表達的影響作用強于CUR。 第二部分聯(lián)氨基姜黃素抑制JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路對人肝癌細胞HepG2的影響 目的:探討姜黃素衍生物——聯(lián)氨基姜黃素（HZC）通過抑制JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路，探討HZC對人肝癌細胞HepG2的影響及其相關機制。 方法:以人肝癌細胞HepG2為研究對象，分DMSO對照組、姜黃素處理組和聯(lián)氨基姜黃素處理組。將HepG2細胞用不同濃度的HZC和CUR(10、20、40μmol/L)分別孵育24h，應用Western blot檢測上述不同處理組HepG2細胞JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導通路相關分子的變化，包括上游分子P-JAK2、JAK2、P-STAT3、STAT3以及下游分子蛋白表達水平。 結(jié)果：Western blot檢測結(jié)果顯示，CUR和HZC能抑制P-JAK2和P-STAT3的蛋白表達，并調(diào)節(jié)其下游與肝癌細胞凋亡的相關分子蛋白表達水平。相同濃度CUR和HZC比較，HZC對肝癌HepG2細胞P-JAK2、P-STAT3、Bcl-2，Bcl-xl，Bax，Cyt c，Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的影響更顯著，差異有顯著性（P0.05或P0.01）。 結(jié)論：CUR和HZC均能顯著降低JAK2和STAT3的活化水平并且影響B(tài)cl-2, Bcl-xl, Bax, Cyt c, Caspase-3和Caspase-9表達。CUR和HZC通過抑制JAK2/STAT3細胞信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)其下游與肝癌細胞生長、凋亡的相關分子蛋白表達水平，從而抑制腫瘤細胞增殖，誘導其凋亡，起到抑制腫瘤的作用。與CUR相比，HZC是一種更為有效的肝癌抑制藥物，具有良好的應用前景。 第三部分聯(lián)氨基姜黃素對二乙基亞硝胺誘導雄性大鼠肝癌發(fā)生的影響 目的：通過動物實驗研究姜黃素(CUR)和聯(lián)氨基姜黃素（HZC）對二乙基亞硝胺（DEN）誘導的SD雄性大鼠肝癌發(fā)生、發(fā)展的影響，為應用于臨床奠定理論和實驗基礎。 方法：1大鼠肝癌模型制備及藥物干預:選取體重為100-120g健康雄性SD大鼠120只。適應性生存一周后，根據(jù)實驗要求隨機分為6組，分別為組1（正常對照組）、組2為肝癌模型組（DEN組）、組3為姜黃素對照組（CUR組）、組4為姜黃素防護組（DEN+CUR組）、組5為聯(lián)氨基姜黃素對照組（HZC組）、組6為聯(lián)氨基姜黃素防護組（DEN+HZC組）。正常對照組以80mg/kg生理鹽水腹腔注射，2次/周，12周后停藥。CUR對照組和HZC對照組以80mg/kg分別給予CUR和HZC腹腔注射，2次/周，12周后停藥。DEN組、DEN+CUR組和DEN+HZC組均給予50mg/kgDEN腹腔注射，2次/周，12周后停藥。同時DEN+CUR組和DEN+HZC組以80mg/kg分別給予CUR和HZC腹腔注射，2次/周，12周后停藥。 2血清學指標測定：第24周實驗結(jié)束處死健在大鼠前抽取其血液，用自動生化分析儀檢測丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、Y-谷氨酞轉(zhuǎn)膚酶(GGT)、總膽紅素水平(TBL)肝功能指標。 3腫瘤行為學觀察：試驗結(jié)束時通過麻醉方法處死各組健在大鼠后立刻將大鼠肝臟解剖出，，并且計數(shù)其腫瘤數(shù)目，并且觀察腫瘤形態(tài)。同時對大鼠體重和肝臟重量進行測量。 4HE染色和免疫組化分析：留取肝組織固定包埋，制成石蠟切片。通過HE染色比較各組大鼠肝組織病理變化。用免疫組化的方法檢測各組大鼠肝組織中增殖細胞核抗原（PCNA）的表達情況。 結(jié)果：1發(fā)病率和存活率：至24周試驗結(jié)束時，2組（DEN組）、4組（DEN+CUR組）、6組（DEN+HZC組）發(fā)病分別為30只、11只和6只，3個對照組均無發(fā)病大鼠。死亡大鼠分別為12只、5只和2只。DEN組和DEN+CUR組之間、DEN組和DEN+HZC組之間的發(fā)病率均具有統(tǒng)計學差異（均P0.01）。三個對照組大鼠均無發(fā)病及死亡。DEN組和CUR+DEN組之間、DEN組和HZC+DEN組之間的存活率均具有統(tǒng)計學差異（P0.05和P0.01）。DEN+CUR組和DEN+HZC組之間存活率及發(fā)病率雖均無顯著差別，但DEN+HZC組發(fā)病率、存活率均優(yōu)于DEN+CUR組。 2肝臟腫瘤：直徑大于6mm記為癌結(jié)節(jié)。DEN組為17.17±1.08個，DEN+CUR組為13.36±2.17個，DEN+HZC組為11.83±3.90個。三個對照組大鼠均無發(fā)現(xiàn)癌結(jié)節(jié)。DEN組和DEN+CUR組之間、DEN組和DEN+HZC組之間的發(fā)病率均具有統(tǒng)計學差異（均P0.05）。DEN+CUR組和DEN+HZC組之間癌結(jié)節(jié)計數(shù)無顯著差別，但DEN+HZC組癌結(jié)節(jié)計數(shù)低于DEN+CUR組。 3體重和肝臟重量：正常對照組的大鼠體重大于DEN組(P0.01)。DEN組的體重、體重增量小于DEN+CUR組和DEN+HZC組，且均具有統(tǒng)計學差異（均p0.01）。DEN組的肝臟相對和絕對重量高于DEN+CUR組和DEN+HZC組，且均具有統(tǒng)計學差異（均p0.01）。正常對照組、CUR組和HZC組間大鼠生長情況相似，體重、體重增長、肝臟相對和絕對重量差異無顯著性(P0.05)。 4肝功能指標：正常對照組、CUR組和HZC組各項肝功能指標正常，差異無顯著性(P0.05)。與正常對照組比較，DEN組大鼠的ALT、AST、ALP、GGT、TBL明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)；DEN+CUR組和DEN+HZC組中各項肝功指標較DEN組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)，尤其是DEN+HZC組。 5肝組織病理學和免疫組化染色：正常組的肝組織顯示肝小葉有正常的結(jié)構(gòu)；CUR組和HZC組顯示出中央靜脈和肝血竇充血；DEN組顯示出癌灶；DEN+CUR組顯示癌灶伴局灶性壞死；DEN+HZC組顯示癌灶伴片狀壞死。正常組無PCNA染色，DEN+CUR組和DEN+HZC組的PCNA陽性率也低于DEN組(P0.01)。 結(jié)論：1給予SD大鼠小劑量多次間斷腹腔注射DEN，可以成功制作大鼠肝癌的動物模型，以模擬人體原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程，進行有關肝癌發(fā)生機理的研究和各種干預試驗。 2HZC對DEN誘發(fā)的雄性大鼠肝癌具有顯著的化學預防作用，明顯降低肝癌的發(fā)生率。此外HZC具有抑制DEN對大鼠肝臟的毒性作用，對肝臟起到具有保護作用。 3HZC可以有效減輕DEN誘導大鼠肝癌病理學的改變，降低DEN誘導的SD大鼠肝癌組織中PCNA的表達，預示著有較好的預后。
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【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R735.7

【引證文獻】

相關期刊論文 前2條

1 魏妍婷;馬三梅;;姜黃素衍生物及復合物抗腫瘤的研究[J];生命科學;2017年04期

2 吳霜霜;戚益銘;馮波;沈敏鶴;;姜黃素抗原發(fā)性肝癌的實驗研究進展[J];生物技術世界;2014年12期

本文編號：1770507