本文選題：動(dòng)脈粥樣硬化 + 斑塊形成��； 參考：《山東大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作為慢性炎癥性病理基礎(chǔ),主要涉及大中動(dòng)脈并可導(dǎo)致冠心病、缺血性壞死、腹主動(dòng)脈瘤、心力衰竭以及腦卒中等多種心腦血管疾病,是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)高致死率和高致殘率的主要危險(xiǎn)因素。作為一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,AS的進(jìn)程涉及多種血管成分、代謝以及免疫炎癥反應(yīng)。近年來(lái),人們已對(duì)AS的發(fā)生機(jī)制進(jìn)行了探究,然而導(dǎo)致AS的具體發(fā)病機(jī)制目前尚不十分明確,因此探究導(dǎo)致AS的危險(xiǎn)因素并探討其致AS的病理機(jī)制已成為當(dāng)今心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,并可為AS的預(yù)防提供有效干預(yù)靶點(diǎn)。脯氨酸羥化酶(Prolyl Hydroxylase domain enzymes, PHDs)屬于亞鐵離子和2-酮戊二酸依賴性羥化酶家族,目前在人類基因組中,發(fā)現(xiàn)了3個(gè)PHDs成員,分別命名為PHD1-PHD3。其中,PHD3在這3種酶中活性最高。因此,PHD2一直是PHDs家族的研究熱點(diǎn)。PHD3的主要作用是調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-Inducible Factor,HIF)的水平和活性。HIF是一種在多種生理狀態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子,它通過(guò)調(diào)節(jié)多種應(yīng)激蛋白的基因表達(dá),調(diào)控如氧化應(yīng)激、血管新生和細(xì)胞凋亡等病理生理過(guò)程。而細(xì)胞內(nèi)感受器PHD3是調(diào)節(jié)HIF-1平衡和活性的重要分子,在常氧狀態(tài)下,它可以將HIF-1α在402及564位的脯氨酸位點(diǎn)羥基化,促進(jìn)HIF-1α的降解,達(dá)到調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的作用。PHD3主要受兩種途徑調(diào)控。第一個(gè)途徑是缺氧/HIF依賴性途徑。在缺氧狀態(tài)下,HIF-1α羥基化和泛素化減少,胞漿中HIF-1α含量上升,增多的HIF-1α能直接結(jié)合到PHD3的啟動(dòng)子上,在轉(zhuǎn)錄水平上促進(jìn)其表達(dá)升高。第二個(gè)途徑是非缺氧相關(guān)途徑。如在小鼠腎小管球旁細(xì)胞中,用血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)刺激細(xì)胞,會(huì)引起PHD3在mRNA和蛋白水平上表達(dá)升高。有研究發(fā)現(xiàn),在微血管栓塞敲除PHD3基因可以減少紅細(xì)胞和血小板聚集、減少血管痙攣,從而緩解癥狀。心肌梗死和缺血再灌注等動(dòng)物模型中,敲除PHD3基因可以減少紅抑制細(xì)胞凋亡和心臟重構(gòu),從而改善心功能。與新生兒肺血管平滑肌細(xì)胞相比,PHD3在成人肺血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)增高,且PHD3的表達(dá)上升與肺血管平滑肌細(xì)胞的凋亡、遷移和分泌等功能相關(guān)。在大鼠主動(dòng)脈球囊拉傷的模型中,PHD3在新生血管中表達(dá)升高,提示PHD3可能參與血管新生的過(guò)程。PHD3還參與調(diào)控多種炎癥細(xì)胞的增殖、分化和凋亡,從而調(diào)控全身及局部的炎癥反應(yīng)。PHD3在巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞中表達(dá)。在中性粒細(xì)胞的相關(guān)研究中,PHD3能夠調(diào)控炎癥細(xì)胞的粘附、趨化和分泌等功能,從而調(diào)控全身及局部的炎癥反應(yīng)。另有研究發(fā)現(xiàn),PHD3在具有促炎功能的巨噬細(xì)胞(M1)中高表達(dá),在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中M1和M2亞型巨噬細(xì)胞可同時(shí)存在于粥樣斑塊內(nèi),在炎癥早期,多種炎性介質(zhì)能夠誘導(dǎo)M1型巨噬細(xì)胞比例升高,M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)多種促炎因子如腫瘤壞死因子α (TNF-α),白介素(interleukin, IL) 6和單核細(xì)胞趨化蛋白(Monocyte chemoattractant protein, MCP) 1等的生成,促進(jìn)炎癥的進(jìn)展。但隨著炎癥進(jìn)一步發(fā)展,M2型巨噬細(xì)胞逐漸增多,可延緩或抑制炎癥反應(yīng),促進(jìn)損傷修復(fù)。前述已有研究證明,PHD3在M1型巨噬細(xì)胞中表達(dá),且在炎癥局部,M1細(xì)胞中PHD3表達(dá)量增多,且PHD3可能促進(jìn)M1細(xì)胞遷移和壞死,促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)的釋放。綜上所述,PHD3在主動(dòng)脈內(nèi)皮、血管平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞中均有表達(dá)。在缺血缺氧、損傷和炎癥等刺激下,細(xì)胞內(nèi)的PHD3能夠接受刺激因素的變化,發(fā)揮其羥化酶的活性,影響其底物蛋白的功能。研究表明,在病理狀態(tài)下,PHD3可以調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞的功能,并促進(jìn)多種炎癥介質(zhì)和金屬基質(zhì)蛋白酶的分泌,影響細(xì)胞外基質(zhì)的穩(wěn)定。由此可見(jiàn),我們推測(cè)PHD3很有可能參與了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生及穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)。但到目前,PHD3在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成過(guò)程中發(fā)揮的作用及對(duì)斑塊穩(wěn)定性的影響,國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道,因此這一問(wèn)題亟待探討和解決。研究目的：1.通過(guò)對(duì)ApoE-/-小鼠轉(zhuǎn)染攜帶PHD3的慢病毒,探究PHD3對(duì)AS斑塊形成的影響；2.探究PHD3對(duì)AS斑塊內(nèi)脂質(zhì)、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及膠原的影響；3.通過(guò)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探究PHD3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響及其相關(guān)信號(hào)通路；研究方法：1.構(gòu)建動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型將100只6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為5組(每組20只),分別為普通飲食組(control組)、高脂組(HFD組)、PHD3高表達(dá)慢病毒干預(yù)組(lv-PHD3組)、PHD3-shRNA干預(yù)組(Sh-PHD3組)和慢病毒空載體干預(yù)組(NC組)。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,對(duì)lv-PHD3組、sh-PHD3組和NC組小鼠分別注射PHD3-lentivirus慢病毒、PHD3-shRNA慢病毒和空載體慢病毒(2×107TU/只)。轉(zhuǎn)染2周后取材,制備冰凍切片,檢測(cè)病毒轉(zhuǎn)染效率。喂養(yǎng)12周后,小鼠預(yù)先禁食12小時(shí)后稱重,用0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉,心臟取血,離心后取上清保存于-80度冰箱。用生理鹽水沖洗小鼠的心臟和主動(dòng)脈,防止血液殘留。部分小鼠繼以4%多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定。剝離小鼠心臟和主動(dòng)脈,部分放入4%多聚甲醛固定,其余動(dòng)物標(biāo)本保存于-80度冰箱。2.主動(dòng)脈表面AS病變?nèi)旧珜⒔萦?%多聚甲醛中的組織取出,從主動(dòng)脈弓到腹主動(dòng)脈分叉處剝離周圍結(jié)締組織成分,延主動(dòng)脈小彎一側(cè)剖開(kāi)組織并展開(kāi)固定于蠟板上,用油紅O染液染色30分鐘,紅色區(qū)域?yàn)楸蝗旧腁S斑塊。AS的病變嚴(yán)重程度用斑塊占整個(gè)主動(dòng)脈表面積的百分比表示。3.主動(dòng)脈根部AS病灶分析以6μm的厚度連續(xù)切小鼠主動(dòng)脈根部,做平行于瓣環(huán)的冰凍切片,后對(duì)斑塊內(nèi)結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行染色,如蘇木素-伊紅染色和油紅O染色,以此分析主動(dòng)脈根部的形態(tài)及檢測(cè)主動(dòng)脈根部的斑塊面積。病變的嚴(yán)重程度用總斑塊面積占整個(gè)瓣環(huán)面積的比例表示。4.組織學(xué)染色選取冰凍切片行PHD3、ICAM-1、VCAM-1、MOMA-2、α-SMA免疫組織化學(xué)染色,明確PHD3表達(dá)對(duì)炎癥因子ICAM-1、VCAM-1以及斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的影響；應(yīng)用天狼猩紅染色和Masson染色,明確PHD3表達(dá)對(duì)斑塊內(nèi)膠原纖維的影響。5. TUNEL染色用冰凍切片行TUNEL染色,檢測(cè)小鼠斑塊內(nèi)的凋亡情況,以及對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色,檢測(cè)PHD3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。6.Western blot分析稱取小鼠主動(dòng)脈組織,或收集細(xì)胞,提取蛋白,以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)PHD3、 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β的蛋白表達(dá)水平；同時(shí)檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。多組之間比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA),兩組之間比較應(yīng)用Student t檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。研究結(jié)果：1.各組小鼠的一般情況在處死動(dòng)物前,對(duì)高脂組、lv-PHD3組、sh-PHD3組及NC組中小鼠的體重、血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示以上指標(biāo)在各組中并不存在濃度差異(P0.05)。這表明PHD3病毒轉(zhuǎn)染并不影響小鼠體內(nèi)整體的脂質(zhì)代謝。2.慢病毒轉(zhuǎn)染后PHD3在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,與control組對(duì)比,HFD組斑塊中PHD3表達(dá)升高(P0.05)。與NC組對(duì)比,PHD3 lentivirus轉(zhuǎn)染組小鼠斑塊中PHD3表達(dá)顯著增高,而PHD3-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染組小鼠斑塊中PHD3顯著減少(P均0.05)。Western blot結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致。這一結(jié)果表明,PHD3病毒可有效干預(yù)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊中PHD3的表達(dá)。3.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響小鼠主動(dòng)脈大體油紅O染色顯示,HFD組較control組斑塊面積顯著增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊面積顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊面積明顯減少(P0.05)。主動(dòng)脈根部橫切面油紅O染色結(jié)果與大體油紅O染色結(jié)果一致。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)的積聚,而抑制PHD3后斑塊內(nèi)脂質(zhì)積聚減少。4.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊及內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響小鼠主動(dòng)脈根部橫切面TUNEL染色結(jié)果顯示,HFD組中細(xì)胞凋亡較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組凋亡程度顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組凋亡程度明顯減輕(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)細(xì)胞的凋亡,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內(nèi)的凋亡情況。內(nèi)皮細(xì)胞的TUNEL染色結(jié)果顯示,與NC組比較,lv-PHD3組中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯(P0.05),而SiPHD3組中內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯減少,表明PHD3的表達(dá)水平與內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡存在密切關(guān)系。5.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響小鼠主動(dòng)脈根部橫切面MOMA-2免疫組化結(jié)果顯示,HFD組中巨噬細(xì)胞數(shù)量較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組中巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯減輕(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的數(shù)量,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞數(shù)量。6.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的影響小鼠主動(dòng)脈根部橫切面α-SMA免疫組化結(jié)果顯示,HFD組斑塊中平滑肌細(xì)胞數(shù)量較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中平滑肌細(xì)胞數(shù)量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的遷移,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內(nèi)的平滑肌細(xì)胞的遷移。7.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)膠原纖維的影響小鼠主動(dòng)脈根部橫切面的天狼猩紅染色和Masson染色結(jié)果顯示,HFD組斑塊中膠原纖維含量較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中膠原纖維含量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中膠原纖維含量明顯減少(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原纖維含量,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內(nèi)的膠原纖維生成。8.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)ICAM-1的影響小鼠主動(dòng)脈根部橫切面ICAM-1免疫組化結(jié)果顯示,HFD組斑塊中ICAM-1較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中ICAM-1含量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中ICAM-1含量明顯減少(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)ICAM-1的表達(dá),而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內(nèi)ICAM-1的表達(dá)。9.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)VCAM-1的影響小鼠主動(dòng)脈根部橫切面VCAM-1免疫組化結(jié)果顯示,HFD組斑塊中VCAM-1較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中VCAM-1含量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中VCAM-1含量明顯減少(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈根部斑塊內(nèi)VCAM-1的表達(dá),而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內(nèi)VCAM-1的表達(dá)。10.PHD3慢病毒轉(zhuǎn)染后對(duì)炎性因子的影響Western Blot結(jié)果顯示,HFD組中MCP-1、TNF-α和IL-1 β的表達(dá)水平較control組升高(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組主動(dòng)脈中MCP-1、TNF-α和IL-1β的表達(dá)量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組主動(dòng)脈中MCP-1、TNF-α和IL-1 β表達(dá)量明顯減少(P0.05)。以上結(jié)果表明,PHD3過(guò)表達(dá)可增加小鼠主動(dòng)脈內(nèi)炎癥因子的表達(dá),而抑制PHD3可顯著抑制炎癥因子的生成。結(jié)論：1.PHD3過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可加速AS斑塊的形成,而抑制PHD3則可減少斑塊的形成；2.PHD3通過(guò)增加動(dòng)脈粥樣硬化斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和平滑肌細(xì)胞遷移促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的形成；3.PHD3過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可促進(jìn)AS斑塊內(nèi)VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)；4. MAPK信號(hào)通路介導(dǎo)了PHD3對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響。背景動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作為慢性炎癥性病理基礎(chǔ),是導(dǎo)致世界范圍內(nèi)高致死率和高致殘率的重要危險(xiǎn)因素。作為一個(gè)復(fù)雜的病理過(guò)程,AS進(jìn)程涉及多種血管成分、代謝以及免疫炎癥反應(yīng)等。AS斑塊的破裂可引起一系列急性心血管事件,如急性冠脈綜合征,嚴(yán)重者可危及生命。近年來(lái),人們已對(duì)影響AS的發(fā)生及斑塊穩(wěn)定性的機(jī)制進(jìn)行了探究,然而影響AS斑塊穩(wěn)定性的具體發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。因此積極尋找導(dǎo)致AS斑塊破裂的靶點(diǎn),并探尋有效的干預(yù)機(jī)制,將為控制AS斑塊破裂提供有效預(yù)防措施,從而降低急性心血管事件的死亡率。內(nèi)臟脂肪素(visfatin)也被稱為前B細(xì)胞集落增強(qiáng)因子(PBEF)和磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)。visfatin是一種脂肪細(xì)胞因子,表現(xiàn)出促炎、胰島素樣作用,并與血脂代謝、胰島素抵抗和胰腺B細(xì)胞功能等密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi),visfatin作為Nampt,其主要作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)NAD代謝,參與細(xì)胞的代謝、生存、凋亡等活動(dòng)。細(xì)胞外,visfatin可通過(guò)促進(jìn)炎癥因子的釋放而促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。Visfatin可調(diào)節(jié)許多促炎因子和抗炎因子的表達(dá)包括IL-6、IL-1β和TNF-α等,其中對(duì)IL-6的影響最為明顯。visfatin還可促進(jìn)TGF-β1的釋放,進(jìn)而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡。在HUVECs中,visfatin可促進(jìn)MMP-2和MMP-9的表達(dá),并可通過(guò)激活ERK1/2以及PI3K/AKT信號(hào)通路增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2 (VEGFR2)的生成。visfatin還可通過(guò)激活NF-κB通路促進(jìn)HUVECs釋放ICAM-1和VCAM-1。除上述visfatin對(duì)炎癥因子表達(dá)的影響外,多個(gè)研究還證實(shí)了visfatin與多種炎癥性疾病密切相關(guān)。在Crohn病和潰瘍性結(jié)腸炎患者血清中visfatin水平較健康人群升高,且在mRNA水平升高更為明顯。在骨關(guān)節(jié)炎中,visfatin可促進(jìn)釋放過(guò)量前列腺素2。此外,visfatin還參與了風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的發(fā)病,RA患者滑膜成纖維細(xì)胞中visfatin水平受toll樣受體配體調(diào)節(jié)。既往研究表明,visfatin與AS之間存在緊密聯(lián)系。在代謝綜合征或頸動(dòng)脈粥樣硬化患者中,血清visfatin水平明顯升高。AS患者頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)visfatin的基因表達(dá)增多,且斑塊內(nèi)visfatin聚集的部位存在大量富含脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞。急性心肌梗死患者血清visfatin水平明顯升高,且Ox-LDL和TNF-α均可誘導(dǎo)患者單核細(xì)胞中visfatin的表達(dá)增加。在男性急性ST段抬高心肌梗死患者中,visfatin被發(fā)現(xiàn)在中性粒細(xì)胞中表達(dá)升高,且visfatin活性也大大增加。在冠狀動(dòng)脈破裂斑塊及巨噬細(xì)胞中,visfatin的表達(dá)明顯上調(diào)。此外,在人內(nèi)皮細(xì)胞中,visfatin還可在mRNA水平促進(jìn)MCP-1和CCR2的表達(dá),從而招募巨噬細(xì)胞到炎癥部位。Visfatin還可上調(diào)CD36和SRA的表達(dá)并下調(diào)ABCA1和ABCG1的表達(dá),從而促進(jìn)了ox-LDL的攝取及減少膽固醇的外流,通過(guò)PI3K及ERK依賴性途徑促進(jìn)了泡沫細(xì)胞的形成。在THP-1細(xì)胞中,visfatin可劑量依賴性的增加EMMPRIN和MMP-9的生成,這一促炎效應(yīng)是通過(guò)NAMPT-MAPK (p38, ERK1/2)-NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,而MMP-9表達(dá)增加可進(jìn)一步降解膠原纖維,使膠原含量減少。綜上所述,visfatin參與了多種炎癥性疾病的進(jìn)展,并促進(jìn)了AS的發(fā)生過(guò)程。在急性心肌梗死患者中血清visfatin水平升高,提示visfatin或許與AS斑塊的破裂密切相關(guān),但其對(duì)AS易損斑塊的作用機(jī)制尚不完全明確。因此,仍存在以下問(wèn)題亟待解決：(1) visfatin對(duì)AS斑塊穩(wěn)定性的具體影響；(2) visfatin對(duì)AS斑塊內(nèi)成分的影響；(3) visfatin發(fā)揮作用的信號(hào)機(jī)制。研究目標(biāo)1.通過(guò)visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染,明確visfatin高表達(dá)對(duì)AS斑塊穩(wěn)定性的影響2.探討visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)AS斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、脂質(zhì)積聚、平渭肌細(xì)胞以及膠原纖維的影響；3.探討visfatin促進(jìn)AS斑塊中MMP-8表達(dá)的相關(guān)信號(hào)通路。研究方法1.構(gòu)建動(dòng)物模型80只6周齡雄性ApoE-/-小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后,對(duì)小鼠行頸動(dòng)脈套管,套管位置在左頸總動(dòng)脈處。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后,隨機(jī)將小鼠分為2組(每組40只),分別為lenti-visfatin組和lenti-null組。Lenti-visfatin組給予1×107 TUvisfatin高表達(dá)慢病毒局部浸潤(rùn),lenti-null組給予1×107TU空載體病毒局部浸潤(rùn)。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后,小鼠預(yù)先禁食12小時(shí)后稱重,用0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉,心臟取血,離心后取上清保存于-80度冰箱。用生理鹽水沖洗小鼠的心臟和主動(dòng)脈,防止血液殘留。部分小鼠繼以4%多聚甲醛進(jìn)行內(nèi)固定。剝離小鼠頸動(dòng)脈,部分放入4%多聚甲醛固定,其余動(dòng)物標(biāo)本保存于-80度冰箱。2.血清學(xué)檢測(cè)檢測(cè)小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。3.頸動(dòng)脈油紅O染色以6μm的厚度連續(xù)切小鼠頸動(dòng)脈,并進(jìn)行油紅O染色,以此分析頸動(dòng)脈處斑塊內(nèi)脂質(zhì)的聚集。病變的嚴(yán)重程度用油紅O陽(yáng)性染色區(qū)域面積占整個(gè)頸動(dòng)脈面積的比例表示。4.組織學(xué)染色選取冰凍切片行visfatin、MOMA-2、α-SMA、MMP-8免疫組織化學(xué)染色,明確visfatin高表達(dá)對(duì)斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及MMP-8的影響；應(yīng)用天狼猩紅染色,明確visfatin高表達(dá)對(duì)斑塊內(nèi)膠原纖維的影響。5.Western blot分析稱取小鼠頸動(dòng)脈組織,或收集細(xì)胞,提取蛋白,以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)visfatin、 MMP-1、MMP-2、MMP-8和MMP-9的蛋白表達(dá)水平；同時(shí)檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞中P65和I κ B α的磷酸化水平。6.實(shí)時(shí)定量PCR (real-time PCR)檢測(cè)應(yīng)用Trizol法提取小鼠頸動(dòng)脈和RAW264.7細(xì)胞總RNA,以β-actin為內(nèi)參,檢測(cè)visfatin和MMP-8的mRNA表達(dá)水平。7.免疫熒光染色取小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片進(jìn)行visfatin、巨噬細(xì)胞及MMP-8的免疫熒光染色,檢測(cè)visfatin在小鼠主動(dòng)脈斑塊內(nèi)的表達(dá)及定位情況。Visfatin刺激RAW264.7細(xì)胞,免疫熒光檢測(cè)MMP-8的表達(dá)。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。多組之間比較應(yīng)用單因素方差分析(ANOVA),兩組之間比較應(yīng)用Student t檢驗(yàn)。P0.05被認(rèn)為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。應(yīng)用SPSS 18.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均重復(fù)三次。研究結(jié)果：1.小鼠的體重及血清學(xué)檢測(cè)指標(biāo)lenti-null組和lenti-visfatin組小鼠在血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平不存在顯著性差異(P0.05),表明lenti-visfatin的局部轉(zhuǎn)染并不影響小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝水平。2. Visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染后在頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)表達(dá)的檢測(cè)在轉(zhuǎn)染后的第3天,組織內(nèi)mRNA水平明顯升高(P0.05),而蛋白水平卻無(wú)明顯變化(P0.05)。轉(zhuǎn)染后第7天,組織內(nèi)mRNA水平和蛋白水平均明顯升高(P0.05)。4周后,lenti-visfatin組中visfatin的表達(dá)仍然顯著高于lenti-null組(P0.05)。以上結(jié)果表明,visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染成功上調(diào)了小鼠頸動(dòng)脈組織中visfatin的表達(dá)。3. Visfatin在頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)主要表達(dá)于單核-巨噬細(xì)胞visfatin和巨噬細(xì)胞免疫熒光共定位結(jié)果顯示,在頸動(dòng)脈斑塊內(nèi),visfatin的綠色熒光與巨噬細(xì)胞的紅色熒光存在高度重合區(qū)域,而在非MOMA-2陽(yáng)性區(qū)域也存在少量綠色熒光,表明visfatin主要來(lái)源于斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞,少量表達(dá)于其他細(xì)胞中。4. Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的影響對(duì)小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片行MOMA-2染色。結(jié)果顯示,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,巨噬細(xì)胞占斑塊面積的比例顯著增加(P0.05),表明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集明顯增加。5. Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響對(duì)小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片行油紅0染色,檢測(cè)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)脂質(zhì)的聚集情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),lenti-visfatin組與lenti-null組相比,脂質(zhì)占頸動(dòng)脈斑塊面積的比例明顯升高(P0.05=,說(shuō)明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞的聚集明顯增加。6.Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的影響對(duì)小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片行α-SMA染色,檢測(cè)斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞的聚集情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),lenti-visfatin組與lenti-null組相比,平滑肌細(xì)胞占頸動(dòng)脈斑塊的面積明顯減少(P0.05=,表明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)平滑肌細(xì)胞數(shù)目減少。7. Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原表達(dá)的影響對(duì)小鼠主動(dòng)脈竇冰凍切片行天狼猩紅染色,檢測(cè)小鼠AS斑塊內(nèi)膠原纖維表達(dá)的情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),lenti-visfatin組與lenti-null組相比,膠原纖維占頸動(dòng)脈斑塊面積的比例明顯減少(P0.05),表明visfatin高表達(dá)可使小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)膠原含量減少。8. Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染對(duì)頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定性的影響斑塊的穩(wěn)定性是通過(guò)易損指數(shù)進(jìn)行評(píng)定的。易損指數(shù)=(巨噬細(xì)胞占斑塊面積的比例+脂質(zhì)占斑塊面積的比例)／(平滑肌細(xì)胞占斑塊面積的比例+膠原占斑塊面積的比例)。經(jīng)計(jì)算后發(fā)現(xiàn),與lenti-null組相比,lenti-visfatin組中斑塊的易損性明顯增加(P0.05=,表明visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可增加小鼠頸動(dòng)脈斑塊的不穩(wěn)定性。9. Visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染上調(diào)頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)MMP-8表達(dá)對(duì)小鼠頸動(dòng)脈冰凍切片行免疫組化染色和western blot檢測(cè)。免疫組化染色結(jié)果顯示,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)MMP-8的表達(dá)明顯增加(P0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果與免疫組化一致。這一結(jié)果說(shuō)明,visfatin高表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染可使小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)MMP-8的表達(dá)上調(diào)。10. Visfatin上調(diào)RAW264.7巨噬細(xì)胞細(xì)胞中MMP-8表達(dá)呈濃度依賴性和時(shí)間依賴性培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞,并給予不同濃度visfatin(0、0.5、5、50和500 ng/ml)刺激。刺激24h后,應(yīng)用western blot法檢測(cè)MMP-8的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,隨著visfatin刺激濃度的增加,MMP-8表達(dá)逐漸增加,且呈劑量依賴性(P0.05)。5 ng/ml的visfatin刺激可顯著升高M(jìn)MP-8水平,當(dāng)visfatin濃度為500 ng/ml時(shí),MMP-8的表達(dá)達(dá)到頂峰。而后以濃度為500 ng/ml的visfatin刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞,刺激時(shí)間分別為0、3、6、12、24和48 h。結(jié)果顯示,visfatin刺激12h可顯著增加visfatin水平,在24h時(shí)其水平達(dá)到頂峰(P0.05)。PCR的結(jié)果與western blot類似。應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)MMP-8的表達(dá)。結(jié)果顯示,用500ng/ml的visfatin刺激24h后,RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)MMP-8的表達(dá)明顯增加(P0.05)。綜上所述,visfatin可同時(shí)在體內(nèi)及體外顯著增加MMP-8的表達(dá),MMP-8表達(dá)增加可進(jìn)一步降低血管內(nèi)膠原從而增加了斑塊的易損性。11. Visfatin上調(diào)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)Western blot法檢測(cè)小鼠頸動(dòng)脈斑塊內(nèi)MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)。結(jié)果顯示,lenti-visfatin組中MMP-1、MMP-2和MMP-9表達(dá)較lenti-null組明顯增加(P0.05)。用500ng/ml的visfatin分別刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞不同時(shí)間長(zhǎng)度,western blot結(jié)果顯示,visfatin刺激24h內(nèi),MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)無(wú)明顯變化(P0.05),但刺激時(shí)間延長(zhǎng)至48h時(shí),MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯升高(P0.05)。與visfatin刺激12h即可使MMP-8表達(dá)明顯增加相比,我們推測(cè)visfatin對(duì)MMP-1、MMP-2和MMP-9影響不是直接的。12.NF-κB信號(hào)通路調(diào)控visfatin誘導(dǎo)的MMP-8上調(diào)Visfatin(500ng/ml)刺激RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞可顯著增加核內(nèi)p65的水平及降低胞漿內(nèi)p65的水平(P0.05),且呈時(shí)間依賴性。同時(shí),胞漿內(nèi)IκBα的磷酸化水平也明顯升高。在刺激8h后,p65和IκBα的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),在12h時(shí)達(dá)到峰值(P0.01)。為進(jìn)一步探究NF-κB通路的作用,我們將兩種NF-κB通路抑制劑BAY11-7082(200M)和SC-514(20μM)預(yù)先加入至細(xì)胞內(nèi),而后再給予visfatin刺激,結(jié)果顯示這兩種抑制劑均可顯著降低visfatin誘導(dǎo)的MMP-8表達(dá)。以上結(jié)果表明,NF-κB信號(hào)通路的激活和轉(zhuǎn)位在visfatin誘導(dǎo)的MMP-8表達(dá)中發(fā)揮重要作用。結(jié)論：1. visfatin與實(shí)驗(yàn)性小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關(guān)；2. visfatin慢病毒轉(zhuǎn)染可顯著降低AS斑塊的穩(wěn)定性；3.visfatin可促進(jìn)MMP-l、2、8、9的表達(dá),且呈劑量和時(shí)間依賴性；4. visfatin通過(guò)NF-κB途徑促進(jìn)MMP-8的表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R543.5
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本文編號(hào)：1767014