本文選題：動脈粥樣硬化 + 斑塊形成�。� 參考：《山東大學》2016年博士論文

【摘要】：研究背景：動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作為慢性炎癥性病理基礎,主要涉及大中動脈并可導致冠心病、缺血性壞死、腹主動脈瘤、心力衰竭以及腦卒中等多種心腦血管疾病,是導致世界范圍內高致死率和高致殘率的主要危險因素。作為一個復雜的病理過程,AS的進程涉及多種血管成分、代謝以及免疫炎癥反應。近年來,人們已對AS的發(fā)生機制進行了探究,然而導致AS的具體發(fā)病機制目前尚不十分明確,因此探究導致AS的危險因素并探討其致AS的病理機制已成為當今心血管領域的研究熱點之一,并可為AS的預防提供有效干預靶點。脯氨酸羥化酶(Prolyl Hydroxylase domain enzymes, PHDs)屬于亞鐵離子和2-酮戊二酸依賴性羥化酶家族,目前在人類基因組中,發(fā)現了3個PHDs成員,分別命名為PHD1-PHD3。其中,PHD3在這3種酶中活性最高。因此,PHD2一直是PHDs家族的研究熱點。PHD3的主要作用是調節(jié)缺氧誘導因子(Hypoxia-Inducible Factor,HIF)的水平和活性。HIF是一種在多種生理狀態(tài)調節(jié)中起關鍵作用的轉錄因子,它通過調節(jié)多種應激蛋白的基因表達,調控如氧化應激、血管新生和細胞凋亡等病理生理過程。而細胞內感受器PHD3是調節(jié)HIF-1平衡和活性的重要分子,在常氧狀態(tài)下,它可以將HIF-1α在402及564位的脯氨酸位點羥基化,促進HIF-1α的降解,達到調節(jié)細胞內穩(wěn)態(tài)的作用。PHD3主要受兩種途徑調控。第一個途徑是缺氧/HIF依賴性途徑。在缺氧狀態(tài)下,HIF-1α羥基化和泛素化減少,胞漿中HIF-1α含量上升,增多的HIF-1α能直接結合到PHD3的啟動子上,在轉錄水平上促進其表達升高。第二個途徑是非缺氧相關途徑。如在小鼠腎小管球旁細胞中,用血管緊張素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)刺激細胞,會引起PHD3在mRNA和蛋白水平上表達升高。有研究發(fā)現,在微血管栓塞敲除PHD3基因可以減少紅細胞和血小板聚集、減少血管痙攣,從而緩解癥狀。心肌梗死和缺血再灌注等動物模型中,敲除PHD3基因可以減少紅抑制細胞凋亡和心臟重構,從而改善心功能。與新生兒肺血管平滑肌細胞相比,PHD3在成人肺血管平滑肌細胞中表達增高,且PHD3的表達上升與肺血管平滑肌細胞的凋亡、遷移和分泌等功能相關。在大鼠主動脈球囊拉傷的模型中,PHD3在新生血管中表達升高,提示PHD3可能參與血管新生的過程。PHD3還參與調控多種炎癥細胞的增殖、分化和凋亡,從而調控全身及局部的炎癥反應。PHD3在巨噬細胞、中性粒細胞和肥大細胞等多種炎癥細胞中表達。在中性粒細胞的相關研究中,PHD3能夠調控炎癥細胞的粘附、趨化和分泌等功能,從而調控全身及局部的炎癥反應。另有研究發(fā)現,PHD3在具有促炎功能的巨噬細胞(M1)中高表達,在AS發(fā)生發(fā)展過程中M1和M2亞型巨噬細胞可同時存在于粥樣斑塊內,在炎癥早期,多種炎性介質能夠誘導M1型巨噬細胞比例升高,M1型巨噬細胞促進多種促炎因子如腫瘤壞死因子α (TNF-α),白介素(interleukin, IL) 6和單核細胞趨化蛋白(Monocyte chemoattractant protein, MCP) 1等的生成,促進炎癥的進展。但隨著炎癥進一步發(fā)展,M2型巨噬細胞逐漸增多,可延緩或抑制炎癥反應,促進損傷修復。前述已有研究證明,PHD3在M1型巨噬細胞中表達,且在炎癥局部,M1細胞中PHD3表達量增多,且PHD3可能促進M1細胞遷移和壞死,促進多種炎癥介質的釋放。綜上所述,PHD3在主動脈內皮、血管平滑肌細胞和巨噬細胞等多種細胞中均有表達。在缺血缺氧、損傷和炎癥等刺激下,細胞內的PHD3能夠接受刺激因素的變化,發(fā)揮其羥化酶的活性,影響其底物蛋白的功能。研究表明,在病理狀態(tài)下,PHD3可以調節(jié)血管平滑肌細胞、巨噬細胞和中性粒細胞等多種細胞的功能,并促進多種炎癥介質和金屬基質蛋白酶的分泌,影響細胞外基質的穩(wěn)定。由此可見,我們推測PHD3很有可能參與了動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生及穩(wěn)定性的調節(jié)。但到目前,PHD3在動脈粥樣硬化斑塊形成過程中發(fā)揮的作用及對斑塊穩(wěn)定性的影響,國內外尚未見相關報道,因此這一問題亟待探討和解決。研究目的：1.通過對ApoE-/-小鼠轉染攜帶PHD3的慢病毒,探究PHD3對AS斑塊形成的影響；2.探究PHD3對AS斑塊內脂質、巨噬細胞、平滑肌細胞及膠原的影響；3.通過體內外實驗探究PHD3對內皮細胞的影響及其相關信號通路；研究方法：1.構建動脈粥樣硬化動物模型將100只6-8周齡雄性ApoE-/-小鼠隨機分為5組(每組20只),分別為普通飲食組(control組)、高脂組(HFD組)、PHD3高表達慢病毒干預組(lv-PHD3組)、PHD3-shRNA干預組(Sh-PHD3組)和慢病毒空載體干預組(NC組)。適應性喂養(yǎng)1周后,對lv-PHD3組、sh-PHD3組和NC組小鼠分別注射PHD3-lentivirus慢病毒、PHD3-shRNA慢病毒和空載體慢病毒(2×107TU/只)。轉染2周后取材,制備冰凍切片,檢測病毒轉染效率。喂養(yǎng)12周后,小鼠預先禁食12小時后稱重,用0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉,心臟取血,離心后取上清保存于-80度冰箱。用生理鹽水沖洗小鼠的心臟和主動脈,防止血液殘留。部分小鼠繼以4%多聚甲醛進行內固定。剝離小鼠心臟和主動脈,部分放入4%多聚甲醛固定,其余動物標本保存于-80度冰箱。2.主動脈表面AS病變染色將浸泡于4%多聚甲醛中的組織取出,從主動脈弓到腹主動脈分叉處剝離周圍結締組織成分,延主動脈小彎一側剖開組織并展開固定于蠟板上,用油紅O染液染色30分鐘,紅色區(qū)域為被染色的AS斑塊。AS的病變嚴重程度用斑塊占整個主動脈表面積的百分比表示。3.主動脈根部AS病灶分析以6μm的厚度連續(xù)切小鼠主動脈根部,做平行于瓣環(huán)的冰凍切片,后對斑塊內結構和成分進行染色,如蘇木素-伊紅染色和油紅O染色,以此分析主動脈根部的形態(tài)及檢測主動脈根部的斑塊面積。病變的嚴重程度用總斑塊面積占整個瓣環(huán)面積的比例表示。4.組織學染色選取冰凍切片行PHD3、ICAM-1、VCAM-1、MOMA-2、α-SMA免疫組織化學染色,明確PHD3表達對炎癥因子ICAM-1、VCAM-1以及斑塊內巨噬細胞和平滑肌細胞的影響；應用天狼猩紅染色和Masson染色,明確PHD3表達對斑塊內膠原纖維的影響。5. TUNEL染色用冰凍切片行TUNEL染色,檢測小鼠斑塊內的凋亡情況,以及對人臍靜脈內皮細胞進行TUNEL染色,檢測PHD3對內皮細胞凋亡的影響。6.Western blot分析稱取小鼠主動脈組織,或收集細胞,提取蛋白,以β-actin為內參,檢測PHD3、 ICAM-1、VCAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β的蛋白表達水平；同時檢測內皮細胞中ERK1/2、JNK及P38的磷酸化水平。7.統(tǒng)計學分析所有結果均以均數±標準差的形式表示。多組之間比較應用單因素方差分析(ANOVA),兩組之間比較應用Student t檢驗。P0.05被認為存在統(tǒng)計學差異。應用SPSS 18.0軟件分析處理數據。所有數據均重復三次。研究結果：1.各組小鼠的一般情況在處死動物前,對高脂組、lv-PHD3組、sh-PHD3組及NC組中小鼠的體重、血清TG、TC、HDL-C及LDL-C水平進行檢測,結果顯示以上指標在各組中并不存在濃度差異(P0.05)。這表明PHD3病毒轉染并不影響小鼠體內整體的脂質代謝。2.慢病毒轉染后PHD3在動脈粥樣硬化斑塊中的表達免疫組化結果顯示,與control組對比,HFD組斑塊中PHD3表達升高(P0.05)。與NC組對比,PHD3 lentivirus轉染組小鼠斑塊中PHD3表達顯著增高,而PHD3-shRNA慢病毒轉染組小鼠斑塊中PHD3顯著減少(P均0.05)。Western blot結果與免疫組化結果一致。這一結果表明,PHD3病毒可有效干預小鼠主動脈根部斑塊中PHD3的表達。3.PHD3慢病毒轉染后對主動脈斑塊內脂質聚集的影響小鼠主動脈大體油紅O染色顯示,HFD組較control組斑塊面積顯著增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊面積顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊面積明顯減少(P0.05)。主動脈根部橫切面油紅O染色結果與大體油紅O染色結果一致。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈斑塊內脂質的積聚,而抑制PHD3后斑塊內脂質積聚減少。4.PHD3慢病毒轉染后對小鼠主動脈根部斑塊及內皮細胞凋亡的影響小鼠主動脈根部橫切面TUNEL染色結果顯示,HFD組中細胞凋亡較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組凋亡程度顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組凋亡程度明顯減輕(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈斑塊內細胞的凋亡,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內的凋亡情況。內皮細胞的TUNEL染色結果顯示,與NC組比較,lv-PHD3組中內皮細胞凋亡數量明顯(P0.05),而SiPHD3組中內皮細胞凋亡明顯減少,表明PHD3的表達水平與內皮細胞的凋亡存在密切關系。5.PHD3慢病毒轉染后對小鼠主動脈根部斑塊內巨噬細胞的影響小鼠主動脈根部橫切面MOMA-2免疫組化結果顯示,HFD組中巨噬細胞數量較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組中巨噬細胞數量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組巨噬細胞數量明顯減輕(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈斑塊內巨噬細胞的數量,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內的巨噬細胞數量。6.PHD3慢病毒轉染后對小鼠主動脈根部斑塊內平滑肌細胞的影響小鼠主動脈根部橫切面α-SMA免疫組化結果顯示,HFD組斑塊中平滑肌細胞數量較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中平滑肌細胞數量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中平滑肌細胞數量明顯減少(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈斑塊內平滑肌細胞的遷移,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內的平滑肌細胞的遷移。7.PHD3慢病毒轉染后對小鼠主動脈根部斑塊內膠原纖維的影響小鼠主動脈根部橫切面的天狼猩紅染色和Masson染色結果顯示,HFD組斑塊中膠原纖維含量較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中膠原纖維含量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中膠原纖維含量明顯減少(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈斑塊內膠原纖維含量,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內的膠原纖維生成。8.PHD3慢病毒轉染后對ICAM-1的影響小鼠主動脈根部橫切面ICAM-1免疫組化結果顯示,HFD組斑塊中ICAM-1較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中ICAM-1含量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中ICAM-1含量明顯減少(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈斑塊內ICAM-1的表達,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內ICAM-1的表達。9.PHD3慢病毒轉染后對VCAM-1的影響小鼠主動脈根部橫切面VCAM-1免疫組化結果顯示,HFD組斑塊中VCAM-1較control組明顯增加(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組斑塊中VCAM-1含量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組斑塊中VCAM-1含量明顯減少(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈根部斑塊內VCAM-1的表達,而抑制PHD3可顯著抑制斑塊內VCAM-1的表達。10.PHD3慢病毒轉染后對炎性因子的影響Western Blot結果顯示,HFD組中MCP-1、TNF-α和IL-1 β的表達水平較control組升高(P0.05)；與NC組比較,lv-PHD3組主動脈中MCP-1、TNF-α和IL-1β的表達量顯著增加(P0.05),而sh-PHD3組主動脈中MCP-1、TNF-α和IL-1 β表達量明顯減少(P0.05)。以上結果表明,PHD3過表達可增加小鼠主動脈內炎癥因子的表達,而抑制PHD3可顯著抑制炎癥因子的生成。結論：1.PHD3過表達慢病毒轉染可加速AS斑塊的形成,而抑制PHD3則可減少斑塊的形成；2.PHD3通過增加動脈粥樣硬化斑塊內巨噬細胞浸潤和平滑肌細胞遷移促進動脈粥樣硬化的形成；3.PHD3過表達慢病毒轉染可促進AS斑塊內VCAM-1和ICAM-1的表達；4. MAPK信號通路介導了PHD3對內皮細胞的影響。背景動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)作為慢性炎癥性病理基礎,是導致世界范圍內高致死率和高致殘率的重要危險因素。作為一個復雜的病理過程,AS進程涉及多種血管成分、代謝以及免疫炎癥反應等。AS斑塊的破裂可引起一系列急性心血管事件,如急性冠脈綜合征,嚴重者可危及生命。近年來,人們已對影響AS的發(fā)生及斑塊穩(wěn)定性的機制進行了探究,然而影響AS斑塊穩(wěn)定性的具體發(fā)病機制目前尚不明確。因此積極尋找導致AS斑塊破裂的靶點,并探尋有效的干預機制,將為控制AS斑塊破裂提供有效預防措施,從而降低急性心血管事件的死亡率。內臟脂肪素(visfatin)也被稱為前B細胞集落增強因子(PBEF)和磷酸核糖轉移酶(Nampt)。visfatin是一種脂肪細胞因子,表現出促炎、胰島素樣作用,并與血脂代謝、胰島素抵抗和胰腺B細胞功能等密切相關。細胞內,visfatin作為Nampt,其主要作用是調節(jié)細胞內NAD代謝,參與細胞的代謝、生存、凋亡等活動。細胞外,visfatin可通過促進炎癥因子的釋放而促進炎癥反應的發(fā)生。Visfatin可調節(jié)許多促炎因子和抗炎因子的表達包括IL-6、IL-1β和TNF-α等,其中對IL-6的影響最為明顯。visfatin還可促進TGF-β1的釋放,進而影響細胞的生長、分化和凋亡。在HUVECs中,visfatin可促進MMP-2和MMP-9的表達,并可通過激活ERK1/2以及PI3K/AKT信號通路增加血管內皮生長因子(VEGF)和血管內皮生長因子受體2 (VEGFR2)的生成。visfatin還可通過激活NF-κB通路促進HUVECs釋放ICAM-1和VCAM-1。除上述visfatin對炎癥因子表達的影響外,多個研究還證實了visfatin與多種炎癥性疾病密切相關。在Crohn病和潰瘍性結腸炎患者血清中visfatin水平較健康人群升高,且在mRNA水平升高更為明顯。在骨關節(jié)炎中,visfatin可促進釋放過量前列腺素2。此外,visfatin還參與了風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)的發(fā)病,RA患者滑膜成纖維細胞中visfatin水平受toll樣受體配體調節(jié)。既往研究表明,visfatin與AS之間存在緊密聯系。在代謝綜合征或頸動脈粥樣硬化患者中,血清visfatin水平明顯升高。AS患者頸動脈斑塊內visfatin的基因表達增多,且斑塊內visfatin聚集的部位存在大量富含脂質的巨噬細胞。急性心肌梗死患者血清visfatin水平明顯升高,且Ox-LDL和TNF-α均可誘導患者單核細胞中visfatin的表達增加。在男性急性ST段抬高心肌梗死患者中,visfatin被發(fā)現在中性粒細胞中表達升高,且visfatin活性也大大增加。在冠狀動脈破裂斑塊及巨噬細胞中,visfatin的表達明顯上調。此外,在人內皮細胞中,visfatin還可在mRNA水平促進MCP-1和CCR2的表達,從而招募巨噬細胞到炎癥部位。Visfatin還可上調CD36和SRA的表達并下調ABCA1和ABCG1的表達,從而促進了ox-LDL的攝取及減少膽固醇的外流,通過PI3K及ERK依賴性途徑促進了泡沫細胞的形成。在THP-1細胞中,visfatin可劑量依賴性的增加EMMPRIN和MMP-9的生成,這一促炎效應是通過NAMPT-MAPK (p38, ERK1/2)-NF-κB信號通路實現的,而MMP-9表達增加可進一步降解膠原纖維,使膠原含量減少。綜上所述,visfatin參與了多種炎癥性疾病的進展,并促進了AS的發(fā)生過程。在急性心肌梗死患者中血清visfatin水平升高,提示visfatin或許與AS斑塊的破裂密切相關,但其對AS易損斑塊的作用機制尚不完全明確。因此,仍存在以下問題亟待解決：(1) visfatin對AS斑塊穩(wěn)定性的具體影響；(2) visfatin對AS斑塊內成分的影響；(3) visfatin發(fā)揮作用的信號機制。研究目標1.通過visfatin慢病毒轉染,明確visfatin高表達對AS斑塊穩(wěn)定性的影響2.探討visfatin慢病毒轉染對AS斑塊內巨噬細胞、脂質積聚、平渭肌細胞以及膠原纖維的影響；3.探討visfatin促進AS斑塊中MMP-8表達的相關信號通路。研究方法1.構建動物模型80只6周齡雄性ApoE-/-小鼠適應性喂養(yǎng)2周后,對小鼠行頸動脈套管,套管位置在左頸總動脈處。繼續(xù)高脂喂養(yǎng)8周后,隨機將小鼠分為2組(每組40只),分別為lenti-visfatin組和lenti-null組。Lenti-visfatin組給予1×107 TUvisfatin高表達慢病毒局部浸潤,lenti-null組給予1×107TU空載體病毒局部浸潤。繼續(xù)喂養(yǎng)4周后,小鼠預先禁食12小時后稱重,用0.8%戊巴比妥腹腔注射麻醉,心臟取血,離心后取上清保存于-80度冰箱。用生理鹽水沖洗小鼠的心臟和主動脈,防止血液殘留。部分小鼠繼以4%多聚甲醛進行內固定。剝離小鼠頸動脈,部分放入4%多聚甲醛固定,其余動物標本保存于-80度冰箱。2.血清學檢測檢測小鼠血清中總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白的水平。3.頸動脈油紅O染色以6μm的厚度連續(xù)切小鼠頸動脈,并進行油紅O染色,以此分析頸動脈處斑塊內脂質的聚集。病變的嚴重程度用油紅O陽性染色區(qū)域面積占整個頸動脈面積的比例表示。4.組織學染色選取冰凍切片行visfatin、MOMA-2、α-SMA、MMP-8免疫組織化學染色,明確visfatin高表達對斑塊內巨噬細胞、平滑肌細胞及MMP-8的影響；應用天狼猩紅染色,明確visfatin高表達對斑塊內膠原纖維的影響。5.Western blot分析稱取小鼠頸動脈組織,或收集細胞,提取蛋白,以β-actin為內參,檢測visfatin、 MMP-1、MMP-2、MMP-8和MMP-9的蛋白表達水平；同時檢測RAW264.7細胞中P65和I κ B α的磷酸化水平。6.實時定量PCR (real-time PCR)檢測應用Trizol法提取小鼠頸動脈和RAW264.7細胞總RNA,以β-actin為內參,檢測visfatin和MMP-8的mRNA表達水平。7.免疫熒光染色取小鼠頸動脈冰凍切片進行visfatin、巨噬細胞及MMP-8的免疫熒光染色,檢測visfatin在小鼠主動脈斑塊內的表達及定位情況。Visfatin刺激RAW264.7細胞,免疫熒光檢測MMP-8的表達。8.統(tǒng)計學分析所有結果均以均數±標準差的形式表示。多組之間比較應用單因素方差分析(ANOVA),兩組之間比較應用Student t檢驗。P0.05被認為存在統(tǒng)計學差異。應用SPSS 18.0軟件分析處理數據。所有數據均重復三次。研究結果：1.小鼠的體重及血清學檢測指標lenti-null組和lenti-visfatin組小鼠在血清TC、TG、LDL-C和HDL-C水平不存在顯著性差異(P0.05),表明lenti-visfatin的局部轉染并不影響小鼠體內脂質代謝水平。2. Visfatin慢病毒轉染后在頸動脈斑塊內表達的檢測在轉染后的第3天,組織內mRNA水平明顯升高(P0.05),而蛋白水平卻無明顯變化(P0.05)。轉染后第7天,組織內mRNA水平和蛋白水平均明顯升高(P0.05)。4周后,lenti-visfatin組中visfatin的表達仍然顯著高于lenti-null組(P0.05)。以上結果表明,visfatin慢病毒轉染成功上調了小鼠頸動脈組織中visfatin的表達。3. Visfatin在頸動脈斑塊內主要表達于單核-巨噬細胞visfatin和巨噬細胞免疫熒光共定位結果顯示,在頸動脈斑塊內,visfatin的綠色熒光與巨噬細胞的紅色熒光存在高度重合區(qū)域,而在非MOMA-2陽性區(qū)域也存在少量綠色熒光,表明visfatin主要來源于斑塊內的巨噬細胞,少量表達于其他細胞中。4. Visfatin高表達慢病毒轉染對頸動脈斑塊內巨噬細胞的影響對小鼠頸動脈冰凍切片行MOMA-2染色。結果顯示,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,巨噬細胞占斑塊面積的比例顯著增加(P0.05),表明visfatin高表達可使小鼠頸動脈斑塊內巨噬細胞的聚集明顯增加。5. Visfatin高表達慢病毒轉染對頸動脈斑塊內脂質聚集的影響對小鼠頸動脈冰凍切片行油紅0染色,檢測頸動脈斑塊內脂質的聚集情況。結果發(fā)現,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,脂質占頸動脈斑塊面積的比例明顯升高(P0.05=,說明visfatin高表達可使小鼠頸動脈斑塊內巨噬細胞的聚集明顯增加。6.Visfatin高表達慢病毒轉染對頸動脈斑塊內平滑肌細胞的影響對小鼠頸動脈冰凍切片行α-SMA染色,檢測斑塊內平滑肌細胞的聚集情況。結果發(fā)現,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,平滑肌細胞占頸動脈斑塊的面積明顯減少(P0.05=,表明visfatin高表達可使小鼠頸動脈斑塊內平滑肌細胞數目減少。7. Visfatin高表達慢病毒轉染對頸動脈斑塊內膠原表達的影響對小鼠主動脈竇冰凍切片行天狼猩紅染色,檢測小鼠AS斑塊內膠原纖維表達的情況。結果發(fā)現,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,膠原纖維占頸動脈斑塊面積的比例明顯減少(P0.05),表明visfatin高表達可使小鼠頸動脈斑塊內膠原含量減少。8. Visfatin高表達慢病毒轉染對頸動脈斑塊穩(wěn)定性的影響斑塊的穩(wěn)定性是通過易損指數進行評定的。易損指數=(巨噬細胞占斑塊面積的比例+脂質占斑塊面積的比例)／(平滑肌細胞占斑塊面積的比例+膠原占斑塊面積的比例)。經計算后發(fā)現,與lenti-null組相比,lenti-visfatin組中斑塊的易損性明顯增加(P0.05=,表明visfatin高表達慢病毒轉染可增加小鼠頸動脈斑塊的不穩(wěn)定性。9. Visfatin高表達慢病毒轉染上調頸動脈斑塊內MMP-8表達對小鼠頸動脈冰凍切片行免疫組化染色和western blot檢測。免疫組化染色結果顯示,lenti-visfatin組與lenti-null組相比,小鼠頸動脈斑塊內MMP-8的表達明顯增加(P0.05)。Western blot檢測結果與免疫組化一致。這一結果說明,visfatin高表達慢病毒轉染可使小鼠頸動脈斑塊內MMP-8的表達上調。10. Visfatin上調RAW264.7巨噬細胞細胞中MMP-8表達呈濃度依賴性和時間依賴性培養(yǎng)RAW264.7小鼠巨噬細胞,并給予不同濃度visfatin(0、0.5、5、50和500 ng/ml)刺激。刺激24h后,應用western blot法檢測MMP-8的蛋白表達。結果顯示,隨著visfatin刺激濃度的增加,MMP-8表達逐漸增加,且呈劑量依賴性(P0.05)。5 ng/ml的visfatin刺激可顯著升高MMP-8水平,當visfatin濃度為500 ng/ml時,MMP-8的表達達到頂峰。而后以濃度為500 ng/ml的visfatin刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞,刺激時間分別為0、3、6、12、24和48 h。結果顯示,visfatin刺激12h可顯著增加visfatin水平,在24h時其水平達到頂峰(P0.05)。PCR的結果與western blot類似。應用免疫熒光檢測RAW264.7小鼠巨噬細胞內MMP-8的表達。結果顯示,用500ng/ml的visfatin刺激24h后,RAW264.7小鼠巨噬細胞內MMP-8的表達明顯增加(P0.05)。綜上所述,visfatin可同時在體內及體外顯著增加MMP-8的表達,MMP-8表達增加可進一步降低血管內膠原從而增加了斑塊的易損性。11. Visfatin上調RAW264.7小鼠巨噬細胞中MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達Western blot法檢測小鼠頸動脈斑塊內MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達。結果顯示,lenti-visfatin組中MMP-1、MMP-2和MMP-9表達較lenti-null組明顯增加(P0.05)。用500ng/ml的visfatin分別刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞不同時間長度,western blot結果顯示,visfatin刺激24h內,MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達無明顯變化(P0.05),但刺激時間延長至48h時,MMP-1、MMP-2和MMP-9的表達明顯升高(P0.05)。與visfatin刺激12h即可使MMP-8表達明顯增加相比,我們推測visfatin對MMP-1、MMP-2和MMP-9影響不是直接的。12.NF-κB信號通路調控visfatin誘導的MMP-8上調Visfatin(500ng/ml)刺激RAW264.7小鼠巨噬細胞可顯著增加核內p65的水平及降低胞漿內p65的水平(P0.05),且呈時間依賴性。同時,胞漿內IκBα的磷酸化水平也明顯升高。在刺激8h后,p65和IκBα的升高具有統(tǒng)計學意義(P0.05),在12h時達到峰值(P0.01)。為進一步探究NF-κB通路的作用,我們將兩種NF-κB通路抑制劑BAY11-7082(200M)和SC-514(20μM)預先加入至細胞內,而后再給予visfatin刺激,結果顯示這兩種抑制劑均可顯著降低visfatin誘導的MMP-8表達。以上結果表明,NF-κB信號通路的激活和轉位在visfatin誘導的MMP-8表達中發(fā)揮重要作用。結論：1. visfatin與實驗性小鼠動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性密切相關；2. visfatin慢病毒轉染可顯著降低AS斑塊的穩(wěn)定性；3.visfatin可促進MMP-l、2、8、9的表達,且呈劑量和時間依賴性；4. visfatin通過NF-κB途徑促進MMP-8的表達。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R543.5
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本文編號：1767013