本文選題：獲得　切入點(diǎn)：整合　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： Wnt蛋白是一種分子量為39-46KD的分泌型糖蛋白,在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。分泌到胞外的Wnt分子與細(xì)胞膜上Frizzled受體結(jié)合后能引起細(xì)胞內(nèi)一系列信號(hào)通路的激活,包括Wnt/β-catenin, Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路。根據(jù)Wnt信號(hào)通路的不同將Wrnt蛋白分為兩大類,即經(jīng)典Wnt蛋白和非經(jīng)典Wnt蛋白。 Wnt受體及其信號(hào)通路中的相關(guān)組分在神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛分布。研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號(hào)通路在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用,如海馬的形成,樹(shù)突形態(tài)構(gòu)建,軸突導(dǎo)向以及突觸形成等。近年來(lái),Wnt在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),Wnts在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的調(diào)控以及成年動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。條件性恐懼記憶訓(xùn)練后,小鼠杏仁體腦區(qū)中的Wnt1mRNA出現(xiàn)了顯著性下降；并且訓(xùn)練前向小鼠杏仁體腦區(qū)注射Wnt1蛋白能引起小鼠長(zhǎng)時(shí)記憶的損傷。與此結(jié)果不同,在水迷宮實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)過(guò)5天訓(xùn)練后,大鼠海馬腦區(qū)的Wnt7和Wnt5a分子有顯著性升高,提示W(wǎng)nt7和Wnt5a可能會(huì)在長(zhǎng)時(shí)記憶過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(the object recognition task,ORT)中,訓(xùn)練后立即向背側(cè)海馬腦區(qū)注射經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑DKK1損傷記憶的整合過(guò)程,說(shuō)明經(jīng)典Wnt信號(hào)通路在海馬依賴的記憶整合過(guò)程中發(fā)揮作用。然而,目前在體研究Wnts參與學(xué)習(xí)記憶的文章較少,并且在這些研究中所選取的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?研究的腦區(qū)各不相同,因此Wnt在學(xué)習(xí)記憶中到底發(fā)揮什么樣的作用?是所有的Wnt分子都參與學(xué)習(xí)記憶過(guò)程還是具有特異性?Wnt調(diào)控學(xué)習(xí)記憶的作用機(jī)制是什么?不同信號(hào)通路在學(xué)習(xí)記憶中的功能有何異同?目前難有定論。 場(chǎng)景性恐懼記憶(contextual fear conditioning, CFC)是基于巴普洛夫條件反射而建立的,它測(cè)定動(dòng)物學(xué)習(xí)、記憶不悅經(jīng)歷和環(huán)境暗示之間關(guān)聯(lián)的能力。實(shí)驗(yàn)中,用環(huán)境作為條件刺激(conditioning stimulus, CS),以厭惡性刺激(如足底電擊)作為非條件刺激(unconditioned stimulus, US),二者配對(duì)出現(xiàn)。動(dòng)物經(jīng)歷條件恐懼后,當(dāng)再次接受到條件刺激時(shí),會(huì)產(chǎn)生一系列的生理反應(yīng),如自主神經(jīng)緊張及防御性行為增多等。不動(dòng)(freezing)即是動(dòng)物防御性行為的一種,被認(rèn)為是評(píng)價(jià)嚙齒類動(dòng)物恐懼的可靠指標(biāo)。這一模型主要用于海馬依賴的記憶。 本課題選取海馬依賴的聯(lián)合性學(xué)習(xí)記憶模型—CFC作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?采用動(dòng)物行為學(xué),腦內(nèi)埋管給藥,慢病毒轉(zhuǎn)染,實(shí)時(shí)定量PCR、免疫熒光及Western blot等分子生物學(xué)方法研究小鼠海馬腦區(qū)中Wnt調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶的作用及其機(jī)制。 目的： 1.探討海馬腦區(qū)哪個(gè)Wnt在CFC記憶形成中發(fā)揮作用。 2.探討Wnt調(diào)節(jié)CFC記憶形成的作用機(jī)制。 方法： 1.CFC記憶的形成 CFC記憶的形成：可分為記憶的獲得及記憶的整合。具體過(guò)程如下：訓(xùn)練期：將動(dòng)物放入測(cè)試箱內(nèi)適應(yīng)2min,然后給予3次足底電擊(0.4mA或0.7mA,2s),兩次電擊之間的間隔為60s。最后一次電擊結(jié)束后,動(dòng)物在測(cè)試箱內(nèi)再放置60s,放回飼養(yǎng)動(dòng)物的籠子中。整個(gè)訓(xùn)練過(guò)程持續(xù)5min。測(cè)試期,即訓(xùn)練期后1h或24h(分別檢測(cè)短期記憶和長(zhǎng)期記憶),將動(dòng)物放回訓(xùn)練的箱子中,持續(xù)5min,在不給予足底電擊的情況下計(jì)算動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間作為記憶的指標(biāo)。不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng),說(shuō)明CFC記憶形成的越好。 2. Real-time PCR 在CFC訓(xùn)練后不同時(shí)間點(diǎn),將小鼠斷頭取腦,冰上迅速分離所需腦組織并提取RNA,通過(guò)分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度,同時(shí)用OD260/280比值及凝膠電泳判斷RNA質(zhì)量,將質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)內(nèi)參actin及目的基因,利用2-△△CT方法來(lái)檢測(cè)目的基因的變化情況。 3. Western blot 在CFC訓(xùn)練后不同時(shí)間點(diǎn),將小鼠斷頭取腦,冰上迅速分離所需腦組織后提取蛋白并檢測(cè)蛋白濃度。按30ug計(jì)算每個(gè)樣品的上樣體積,將蛋白變性后進(jìn)行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,3%的脫脂牛奶或BSA封閉完畢后分別加入相應(yīng)一抗孵育過(guò)夜,洗滌完畢后加入二抗孵育1h,洗完后用ECL顯色。 4.免疫熒光技術(shù) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)相應(yīng)處理后,用5%水合氯醛麻醉然后用新鮮配制的4%多聚甲醛灌流取腦,后固定,30%蔗糖沉糖后冰凍切片,厚度為30μm,然后進(jìn)行免疫熒光染色。具體步驟如下：1)洗滌,將腦片放到6孔板,用TBST洗3遍,每次10分鐘；2)透化與封閉,0.1M TBS,0.3%trition,10%山羊血清室溫封閉1小時(shí)；3)一抗孵育,加入抗Wnt3a或GFP一抗后,靜音混勻器上4℃C過(guò)夜；4)洗滌,TBST洗3遍,每次10分鐘；5)二抗孵育,加入相應(yīng)熒光二抗,避光室溫孵育1小時(shí)；6)洗滌,TBST洗3遍,每次10分鐘；7)貼片,加入防熒光淬滅劑,封片。 5.腦內(nèi)埋管技術(shù) 將雄性C57BL/6小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀,剪開(kāi)頭皮,充分暴露顱骨表面,在顯微鏡下找準(zhǔn)前囟點(diǎn),以此為零點(diǎn)根據(jù)背側(cè)海馬及杏仁體腦區(qū)坐標(biāo)分別調(diào)整立體定位儀的X軸及Y軸,并找到相應(yīng)腦區(qū)在顱骨表面的定位,在該位置鉆孔后,將帶有套管的Z軸經(jīng)孔下移直至目的腦區(qū),固定套管并放入內(nèi)芯以防止套管堵塞。縫合頭皮并將小鼠放回鼠籠恢復(fù)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)套管向特定腦區(qū)注射干預(yù)藥物。然后觀察小鼠行為的改變情況。 6.Lentivirus載體系統(tǒng)構(gòu)建 按4-5×106cell/ml的密度將293T細(xì)胞接種于10cm的皿中,24h后轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前2h換液。轉(zhuǎn)染時(shí)將包裝質(zhì)粒及重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,進(jìn)行病毒包裝和生產(chǎn),48-72h后收集病毒液；濃縮、純化病毒液；用高質(zhì)量的病毒液感染細(xì)胞；通過(guò)免疫熒光測(cè)定病毒滴度并通過(guò)免疫組化法分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果；最后用高質(zhì)量的病毒感染宿主細(xì)胞,通過(guò)行為學(xué)檢測(cè)目的質(zhì)粒在CFC學(xué)習(xí)記憶中的作用。 結(jié)果： 1.CFC學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練能誘導(dǎo)小鼠背側(cè)海馬腦區(qū)中Wnt3a特異性表達(dá)增加。 CFC訓(xùn)練后不同時(shí)間點(diǎn)快速取腦分離出背側(cè)海馬,用Real-time PCR和Western blot檢測(cè)背側(cè)海馬腦區(qū)分布較多的Wnt分子的mRNA及蛋白的表達(dá)變化。結(jié)果顯示,CFC訓(xùn)練后,海馬中Wnt3a mRNA及蛋白有顯著性升高。并且Wnt3a蛋白水平的升高稍落后于mRNA的升高。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),Wnt3a mRNA的升高是特異性的。Wnt家族其他成員(Wnt1、3、4、5a及7a),它們mRNA的表達(dá)水平在CFC訓(xùn)練后沒(méi)有變化。另外,Wnt3a mRNA的升高具有腦區(qū)特異性。CFC訓(xùn)練對(duì)杏仁核腦區(qū)Wnt3a mRNA沒(méi)有影響。為了確認(rèn)Wnt3a的表達(dá)變化是CFC條件性學(xué)習(xí)誘導(dǎo)的,我們?cè)O(shè)立了不同的行為學(xué)對(duì)照組,包括單獨(dú)給予條件刺激(CS組),單獨(dú)給予非條件刺激(US組),來(lái)觀察Wnt3a的表達(dá)變化是否是CFC學(xué)習(xí)記憶誘導(dǎo)的。研究發(fā)現(xiàn),海馬腦區(qū)中Wnt3a的表達(dá)變化是由于CFC訓(xùn)練過(guò)程中CS和US的偶聯(lián)學(xué)習(xí)誘導(dǎo)的,并不是CS或US的單獨(dú)作用。 2.CFC訓(xùn)練引起Wnt3a依賴的Wnt/β-catenin及Wnt/Ca2+信號(hào)通路的激活及Wnt3a的釋放。 Wnt3a需要從神經(jīng)元內(nèi)釋放后與膜上的Frizzled受體及輔助受體LRP5/6結(jié)合,誘發(fā)Disheveld磷酸化,引起下游GSK3β失活,從而使胞漿內(nèi)P-catenin穩(wěn)定存在然后聚集進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄,從而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。在CFC訓(xùn)練后我們通過(guò)Western blot的方法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Wnt3a下游信號(hào)通路的活化情況。結(jié)果顯示,CFC訓(xùn)練1h后,p-GSK3β (ser9)明顯升高,并且維持到CFC訓(xùn)練后3h。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),CFC訓(xùn)練后,胞漿中總的β-catenin的含量沒(méi)有變化,但active-p-catenin含量在2、3小時(shí)有顯著性升高。并且,胞核內(nèi)β-catenin含量在2、3小時(shí)出現(xiàn)了顯著性升高,提示核內(nèi)β-catenin可能在CFC記憶中發(fā)揮重要作用。為了進(jìn)一步確認(rèn)CFC訓(xùn)練能引起β-catenin入核發(fā)揮作用,我們通過(guò)Real-timePCR檢測(cè)β-catenin下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示,CFC訓(xùn)練能引起β-catenin下游靶基因mRNA含量的升高。除了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活,我們發(fā)現(xiàn)CFC訓(xùn)練也能引起突觸中p-CaMKⅡ的升高,說(shuō)明CFC訓(xùn)練能引起Wnt/Ca2+信號(hào)通路的激活。 我們研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a mRNA及蛋白的升高分別發(fā)生在CFC訓(xùn)練后2h和3h,而Wnt信號(hào)通路的激活早于Wnt3a合成增加,提示CFC記憶形成過(guò)程可能首先誘導(dǎo)Wnt3a的分泌釋放,然后出現(xiàn)Wnt3a的合成增加。為了更加確認(rèn)這一結(jié)果,我們通過(guò)免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn),與未經(jīng)訓(xùn)練小鼠海馬腦區(qū)Wnt3a熒光強(qiáng)度相比,CFC訓(xùn)練引起小鼠海馬腦區(qū)Wnt3a熒光強(qiáng)度下調(diào),從而進(jìn)一步確定CFC訓(xùn)練能誘導(dǎo)Wnt3a的釋放。 以上結(jié)果證明,CFC訓(xùn)練能引起Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+信號(hào)通路的激活,那么這些信號(hào)通路的激活是否依賴于Wnt3a的作用。為了解決這一問(wèn)題,我們采用訓(xùn)練前海馬內(nèi)微量注射Wnt3a中和抗體的方法,發(fā)現(xiàn)CFC訓(xùn)練引起的突觸中p-CaMKII的升高被部分阻斷。此外,海馬內(nèi)注射WNt3a抗體能完全阻斷CFC訓(xùn)練引起的核內(nèi)β-catenin及其下游靶基因mRNA的升高。說(shuō)明Wnt/p-catenin與Wnt/Ca2+信號(hào)通路的激活依賴于Wnt3a的作用。 3.訓(xùn)練前海馬腦區(qū)注射Wnt3a抗體損傷CFC記憶的獲得。 為了探討Wnt3a在CFC記憶中的作用,我們采用訓(xùn)練前海馬內(nèi)微量注射Wnt3a中和抗體的方法,發(fā)現(xiàn)CFC記憶的獲得受到損傷。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CFC短期記憶(short term memory, STM)及長(zhǎng)期記憶(ong term memory, LTM)均受到不同程度的損傷。而訓(xùn)練前向杏仁核腦區(qū)注射Wnt3a中和抗體抗體對(duì)CFCSTM及LTM沒(méi)有影響。 4.訓(xùn)練后海馬腦區(qū)立即注射Wnt3a抗體損傷CFC記憶的整合。 為了進(jìn)一步探討Wnt3a在不同記憶過(guò)程中的作用,我們通過(guò)改變給藥時(shí)間的方式檢測(cè)Wnt3a在不同記憶過(guò)程的作用。結(jié)果顯示,訓(xùn)練后立即給予Wnt3a抗體對(duì)CFC STM無(wú)影響,卻損傷了CFC LTM。說(shuō)明Wnt3a參與CFC記憶的整合過(guò)程。而LTM測(cè)試前注射Wnt3a抗體對(duì)CFC LTM沒(méi)有影響,說(shuō)明Wnt3a對(duì)CFC記憶的表達(dá)沒(méi)有影響。 5. Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信號(hào)通路分別參與CFC記憶的獲得及整合。 為了研究Wnt3a通過(guò)哪條信號(hào)參與CFC記憶的整合過(guò)程,我們采用訓(xùn)練后海馬內(nèi)立即注射Wnt3a中和抗體的方法,發(fā)現(xiàn)特異性阻斷Wnt3a對(duì)CFC訓(xùn)練引起的突觸中p-CaMKII的升高沒(méi)有影響。但是,特異性阻斷Wnt3a能完全阻斷CFC訓(xùn)練引起的核內(nèi)P-catenin及其下游靶基因mRNA的升高。說(shuō)明Wnt3a通過(guò)調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路而非Wnt/Ca2+信號(hào)通路調(diào)控CFC記憶的整合。 為了進(jìn)一步區(qū)分Wnt/β-catenin及Wnt/Ca2+信號(hào)通路在CFC記憶不同階段的作用,我們采用訓(xùn)練后向海馬內(nèi)立即注射DKK1和sFRP1的方法。結(jié)果顯示,DKK1能完全阻斷CFC訓(xùn)練引起的核內(nèi)β-catenin的升高而對(duì)突觸中p-CaMKII的升高沒(méi)有影響。sFRP1則能阻斷突觸中p-CaMKII及核內(nèi)β-catenin的升高。 行為學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn),海馬內(nèi)中注射DKK1抗體不影響CFC的短期記憶(short term memory, STM),但損害CFC的長(zhǎng)期記憶(long term memory, LTM);而sFRP1注射同時(shí)干擾了CFC的短期和長(zhǎng)期記憶。以上結(jié)果,提示W(wǎng)nt/Ca2+及Wnt/p-catenin信號(hào)通路分別參與CFC記憶的獲得及整合 6.海馬內(nèi)注射重組Wnt3a能夠增強(qiáng)CFC記憶。 我們發(fā)現(xiàn)在CFC訓(xùn)練過(guò)程中給予一個(gè)較弱的足底電擊后導(dǎo)致形成的記憶減弱,與此同時(shí)突觸中p-CaMKII磷酸化和核內(nèi)β-catenin的含量降低；在這種弱訓(xùn)練后海馬內(nèi)注射重組Wnt3a能夠增強(qiáng)突觸中p-CaMKII磷酸化和核內(nèi)β-catenin的含量,并強(qiáng)化CFC記憶的形成。 7. β-catenin作為Wnt3a的下游分子增強(qiáng)CFC記憶的整合。 為了更好的揭示W(wǎng)nt3a調(diào)控CFC學(xué)習(xí)記憶的機(jī)制,我們通過(guò)慢病毒過(guò)表達(dá)穩(wěn)定存在的ΔN90β-catenin觀察對(duì)CFC學(xué)習(xí)記憶的影響。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)active-β-catenin能增強(qiáng)CFC記憶的整合過(guò)程而對(duì)CFC記憶的獲得沒(méi)有影響。而CFC訓(xùn)練前分別向active-β-catenin過(guò)表達(dá)小鼠及對(duì)照小鼠海馬內(nèi)注射Wnt3a抗體,發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)active-β-catenin糾正Wnt3a抗體引起的CFC LTM的損傷,而對(duì)CFC STM沒(méi)有影響,進(jìn)一步確定β-catenin作歲Wnt3a的下游分子特異的增強(qiáng)CFC記憶的整合而對(duì)CFC記憶的獲得沒(méi)有影響。 結(jié)論： 1.CFC學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練能誘導(dǎo)小鼠海馬腦區(qū)中Wnt3a特異性表達(dá)增加。 2.CFC學(xué)習(xí)記憶訓(xùn)練能引起海馬腦區(qū)Wnt3a的釋放,并且Wnt3a的釋放早于Wnt3a的合成,同時(shí)CFC訓(xùn)練能引起Wnt3a下游信號(hào)通路Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信號(hào)通路的激活。 3.Wnt3a是CFC記憶形成的必要且充分條件。 4.Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信號(hào)通路分別參與CFC記憶的獲得及整合過(guò)程。 5.在海馬腦區(qū)內(nèi)過(guò)表達(dá)激活型β-catenin能特異性糾正Wnt3a抗體引起的CFC記憶整合的缺陷,而對(duì)CFC記憶的獲得沒(méi)有影響。 意義： 本課題旨在使我們了解Wnt3a參與CFC學(xué)習(xí)記憶的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制,并為將來(lái)以Wnt通路為靶標(biāo)的記憶干預(yù)提供新思路和新方法。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：Q42
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本文編號(hào)：1690530