本文選題：獲得　切入點：整合　出處：《山東大學》2014年博士論文

【摘要】：研究背景： Wnt蛋白是一種分子量為39-46KD的分泌型糖蛋白,在進化過程中高度保守。分泌到胞外的Wnt分子與細胞膜上Frizzled受體結(jié)合后能引起細胞內(nèi)一系列信號通路的激活,包括Wnt/β-catenin, Wnt/Ca2+和Wnt/PCP通路。根據(jù)Wnt信號通路的不同將Wrnt蛋白分為兩大類,即經(jīng)典Wnt蛋白和非經(jīng)典Wnt蛋白。 Wnt受體及其信號通路中的相關(guān)組分在神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛分布。研究發(fā)現(xiàn),Wnt信號通路在神經(jīng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用,如海馬的形成,樹突形態(tài)構(gòu)建,軸突導向以及突觸形成等。近年來,Wnt在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用也越來越受到人們的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),Wnts在成熟中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸可塑性的調(diào)控以及成年動物的學習記憶過程中發(fā)揮著重要作用。條件性恐懼記憶訓練后,小鼠杏仁體腦區(qū)中的Wnt1mRNA出現(xiàn)了顯著性下降；并且訓練前向小鼠杏仁體腦區(qū)注射Wnt1蛋白能引起小鼠長時記憶的損傷。與此結(jié)果不同,在水迷宮實驗中,經(jīng)過5天訓練后,大鼠海馬腦區(qū)的Wnt7和Wnt5a分子有顯著性升高,提示W(wǎng)nt7和Wnt5a可能會在長時記憶過程中發(fā)揮重要作用。在物體識別實驗(the object recognition task,ORT)中,訓練后立即向背側(cè)海馬腦區(qū)注射經(jīng)典Wnt信號通路抑制劑DKK1損傷記憶的整合過程,說明經(jīng)典Wnt信號通路在海馬依賴的記憶整合過程中發(fā)揮作用。然而,目前在體研究Wnts參與學習記憶的文章較少,并且在這些研究中所選取的實驗模型,研究的腦區(qū)各不相同,因此Wnt在學習記憶中到底發(fā)揮什么樣的作用?是所有的Wnt分子都參與學習記憶過程還是具有特異性?Wnt調(diào)控學習記憶的作用機制是什么?不同信號通路在學習記憶中的功能有何異同?目前難有定論。 場景性恐懼記憶(contextual fear conditioning, CFC)是基于巴普洛夫條件反射而建立的,它測定動物學習、記憶不悅經(jīng)歷和環(huán)境暗示之間關(guān)聯(lián)的能力。實驗中,用環(huán)境作為條件刺激(conditioning stimulus, CS),以厭惡性刺激(如足底電擊)作為非條件刺激(unconditioned stimulus, US),二者配對出現(xiàn)。動物經(jīng)歷條件恐懼后,當再次接受到條件刺激時,會產(chǎn)生一系列的生理反應,如自主神經(jīng)緊張及防御性行為增多等。不動(freezing)即是動物防御性行為的一種,被認為是評價嚙齒類動物恐懼的可靠指標。這一模型主要用于海馬依賴的記憶。 本課題選取海馬依賴的聯(lián)合性學習記憶模型—CFC作為實驗模型,采用動物行為學,腦內(nèi)埋管給藥,慢病毒轉(zhuǎn)染,實時定量PCR、免疫熒光及Western blot等分子生物學方法研究小鼠海馬腦區(qū)中Wnt調(diào)節(jié)學習記憶的作用及其機制。 目的： 1.探討海馬腦區(qū)哪個Wnt在CFC記憶形成中發(fā)揮作用。 2.探討Wnt調(diào)節(jié)CFC記憶形成的作用機制。 方法： 1.CFC記憶的形成 CFC記憶的形成：可分為記憶的獲得及記憶的整合。具體過程如下：訓練期：將動物放入測試箱內(nèi)適應2min,然后給予3次足底電擊(0.4mA或0.7mA,2s),兩次電擊之間的間隔為60s。最后一次電擊結(jié)束后,動物在測試箱內(nèi)再放置60s,放回飼養(yǎng)動物的籠子中。整個訓練過程持續(xù)5min。測試期,即訓練期后1h或24h(分別檢測短期記憶和長期記憶),將動物放回訓練的箱子中,持續(xù)5min,在不給予足底電擊的情況下計算動物的不動時間作為記憶的指標。不動時間越長,說明CFC記憶形成的越好。 2. Real-time PCR 在CFC訓練后不同時間點,將小鼠斷頭取腦,冰上迅速分離所需腦組織并提取RNA,通過分光光度計檢測RNA濃度,同時用OD260/280比值及凝膠電泳判斷RNA質(zhì)量,將質(zhì)量合格的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,最后通過Real-time PCR檢測內(nèi)參actin及目的基因,利用2-△△CT方法來檢測目的基因的變化情況。 3. Western blot 在CFC訓練后不同時間點,將小鼠斷頭取腦,冰上迅速分離所需腦組織后提取蛋白并檢測蛋白濃度。按30ug計算每個樣品的上樣體積,將蛋白變性后進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜,3%的脫脂牛奶或BSA封閉完畢后分別加入相應一抗孵育過夜,洗滌完畢后加入二抗孵育1h,洗完后用ECL顯色。 4.免疫熒光技術(shù) 實驗動物經(jīng)相應處理后,用5%水合氯醛麻醉然后用新鮮配制的4%多聚甲醛灌流取腦,后固定,30%蔗糖沉糖后冰凍切片,厚度為30μm,然后進行免疫熒光染色。具體步驟如下：1)洗滌,將腦片放到6孔板,用TBST洗3遍,每次10分鐘；2)透化與封閉,0.1M TBS,0.3%trition,10%山羊血清室溫封閉1小時；3)一抗孵育,加入抗Wnt3a或GFP一抗后,靜音混勻器上4℃C過夜；4)洗滌,TBST洗3遍,每次10分鐘；5)二抗孵育,加入相應熒光二抗,避光室溫孵育1小時；6)洗滌,TBST洗3遍,每次10分鐘；7)貼片,加入防熒光淬滅劑,封片。 5.腦內(nèi)埋管技術(shù) 將雄性C57BL/6小鼠麻醉后固定于腦立體定位儀,剪開頭皮,充分暴露顱骨表面,在顯微鏡下找準前囟點,以此為零點根據(jù)背側(cè)海馬及杏仁體腦區(qū)坐標分別調(diào)整立體定位儀的X軸及Y軸,并找到相應腦區(qū)在顱骨表面的定位,在該位置鉆孔后,將帶有套管的Z軸經(jīng)孔下移直至目的腦區(qū),固定套管并放入內(nèi)芯以防止套管堵塞�？p合頭皮并將小鼠放回鼠籠恢復一周后開始實驗。按照實驗設計在不同時間點通過套管向特定腦區(qū)注射干預藥物。然后觀察小鼠行為的改變情況。 6.Lentivirus載體系統(tǒng)構(gòu)建 按4-5×106cell/ml的密度將293T細胞接種于10cm的皿中,24h后轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染前2h換液。轉(zhuǎn)染時將包裝質(zhì)粒及重組載體共轉(zhuǎn)染293T細胞,進行病毒包裝和生產(chǎn),48-72h后收集病毒液；濃縮、純化病毒液；用高質(zhì)量的病毒液感染細胞；通過免疫熒光測定病毒滴度并通過免疫組化法分析實驗結(jié)果；最后用高質(zhì)量的病毒感染宿主細胞,通過行為學檢測目的質(zhì)粒在CFC學習記憶中的作用。 結(jié)果： 1.CFC學習記憶訓練能誘導小鼠背側(cè)海馬腦區(qū)中Wnt3a特異性表達增加。 CFC訓練后不同時間點快速取腦分離出背側(cè)海馬,用Real-time PCR和Western blot檢測背側(cè)海馬腦區(qū)分布較多的Wnt分子的mRNA及蛋白的表達變化。結(jié)果顯示,CFC訓練后,海馬中Wnt3a mRNA及蛋白有顯著性升高。并且Wnt3a蛋白水平的升高稍落后于mRNA的升高。同時我們發(fā)現(xiàn),Wnt3a mRNA的升高是特異性的。Wnt家族其他成員(Wnt1、3、4、5a及7a),它們mRNA的表達水平在CFC訓練后沒有變化。另外,Wnt3a mRNA的升高具有腦區(qū)特異性。CFC訓練對杏仁核腦區(qū)Wnt3a mRNA沒有影響。為了確認Wnt3a的表達變化是CFC條件性學習誘導的,我們設立了不同的行為學對照組,包括單獨給予條件刺激(CS組),單獨給予非條件刺激(US組),來觀察Wnt3a的表達變化是否是CFC學習記憶誘導的。研究發(fā)現(xiàn),海馬腦區(qū)中Wnt3a的表達變化是由于CFC訓練過程中CS和US的偶聯(lián)學習誘導的,并不是CS或US的單獨作用。 2.CFC訓練引起Wnt3a依賴的Wnt/β-catenin及Wnt/Ca2+信號通路的激活及Wnt3a的釋放。 Wnt3a需要從神經(jīng)元內(nèi)釋放后與膜上的Frizzled受體及輔助受體LRP5/6結(jié)合,誘發(fā)Disheveld磷酸化,引起下游GSK3β失活,從而使胞漿內(nèi)P-catenin穩(wěn)定存在然后聚集進入細胞核內(nèi)啟動基因轉(zhuǎn)錄,從而產(chǎn)生生物學效應。在CFC訓練后我們通過Western blot的方法檢測不同時間點Wnt3a下游信號通路的活化情況。結(jié)果顯示,CFC訓練1h后,p-GSK3β (ser9)明顯升高,并且維持到CFC訓練后3h。進一步研究發(fā)現(xiàn),CFC訓練后,胞漿中總的β-catenin的含量沒有變化,但active-p-catenin含量在2、3小時有顯著性升高。并且,胞核內(nèi)β-catenin含量在2、3小時出現(xiàn)了顯著性升高,提示核內(nèi)β-catenin可能在CFC記憶中發(fā)揮重要作用。為了進一步確認CFC訓練能引起β-catenin入核發(fā)揮作用,我們通過Real-timePCR檢測β-catenin下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。結(jié)果顯示,CFC訓練能引起β-catenin下游靶基因mRNA含量的升高。除了經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路的激活,我們發(fā)現(xiàn)CFC訓練也能引起突觸中p-CaMKⅡ的升高,說明CFC訓練能引起Wnt/Ca2+信號通路的激活。 我們研究發(fā)現(xiàn)Wnt3a mRNA及蛋白的升高分別發(fā)生在CFC訓練后2h和3h,而Wnt信號通路的激活早于Wnt3a合成增加,提示CFC記憶形成過程可能首先誘導Wnt3a的分泌釋放,然后出現(xiàn)Wnt3a的合成增加。為了更加確認這一結(jié)果,我們通過免疫熒光的方法發(fā)現(xiàn),與未經(jīng)訓練小鼠海馬腦區(qū)Wnt3a熒光強度相比,CFC訓練引起小鼠海馬腦區(qū)Wnt3a熒光強度下調(diào),從而進一步確定CFC訓練能誘導Wnt3a的釋放。 以上結(jié)果證明,CFC訓練能引起Wnt/β-catenin and Wnt/Ca2+信號通路的激活,那么這些信號通路的激活是否依賴于Wnt3a的作用。為了解決這一問題,我們采用訓練前海馬內(nèi)微量注射Wnt3a中和抗體的方法,發(fā)現(xiàn)CFC訓練引起的突觸中p-CaMKII的升高被部分阻斷。此外,海馬內(nèi)注射WNt3a抗體能完全阻斷CFC訓練引起的核內(nèi)β-catenin及其下游靶基因mRNA的升高。說明Wnt/p-catenin與Wnt/Ca2+信號通路的激活依賴于Wnt3a的作用。 3.訓練前海馬腦區(qū)注射Wnt3a抗體損傷CFC記憶的獲得。 為了探討Wnt3a在CFC記憶中的作用,我們采用訓練前海馬內(nèi)微量注射Wnt3a中和抗體的方法,發(fā)現(xiàn)CFC記憶的獲得受到損傷。進一步實驗發(fā)現(xiàn),CFC短期記憶(short term memory, STM)及長期記憶(ong term memory, LTM)均受到不同程度的損傷。而訓練前向杏仁核腦區(qū)注射Wnt3a中和抗體抗體對CFCSTM及LTM沒有影響。 4.訓練后海馬腦區(qū)立即注射Wnt3a抗體損傷CFC記憶的整合。 為了進一步探討Wnt3a在不同記憶過程中的作用,我們通過改變給藥時間的方式檢測Wnt3a在不同記憶過程的作用。結(jié)果顯示,訓練后立即給予Wnt3a抗體對CFC STM無影響,卻損傷了CFC LTM。說明Wnt3a參與CFC記憶的整合過程。而LTM測試前注射Wnt3a抗體對CFC LTM沒有影響,說明Wnt3a對CFC記憶的表達沒有影響。 5. Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信號通路分別參與CFC記憶的獲得及整合。 為了研究Wnt3a通過哪條信號參與CFC記憶的整合過程,我們采用訓練后海馬內(nèi)立即注射Wnt3a中和抗體的方法,發(fā)現(xiàn)特異性阻斷Wnt3a對CFC訓練引起的突觸中p-CaMKII的升高沒有影響。但是,特異性阻斷Wnt3a能完全阻斷CFC訓練引起的核內(nèi)P-catenin及其下游靶基因mRNA的升高。說明Wnt3a通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號通路而非Wnt/Ca2+信號通路調(diào)控CFC記憶的整合。 為了進一步區(qū)分Wnt/β-catenin及Wnt/Ca2+信號通路在CFC記憶不同階段的作用,我們采用訓練后向海馬內(nèi)立即注射DKK1和sFRP1的方法。結(jié)果顯示,DKK1能完全阻斷CFC訓練引起的核內(nèi)β-catenin的升高而對突觸中p-CaMKII的升高沒有影響。sFRP1則能阻斷突觸中p-CaMKII及核內(nèi)β-catenin的升高。 行為學結(jié)果發(fā)現(xiàn),海馬內(nèi)中注射DKK1抗體不影響CFC的短期記憶(short term memory, STM),但損害CFC的長期記憶(long term memory, LTM);而sFRP1注射同時干擾了CFC的短期和長期記憶。以上結(jié)果,提示W(wǎng)nt/Ca2+及Wnt/p-catenin信號通路分別參與CFC記憶的獲得及整合 6.海馬內(nèi)注射重組Wnt3a能夠增強CFC記憶。 我們發(fā)現(xiàn)在CFC訓練過程中給予一個較弱的足底電擊后導致形成的記憶減弱,與此同時突觸中p-CaMKII磷酸化和核內(nèi)β-catenin的含量降低；在這種弱訓練后海馬內(nèi)注射重組Wnt3a能夠增強突觸中p-CaMKII磷酸化和核內(nèi)β-catenin的含量,并強化CFC記憶的形成。 7. β-catenin作為Wnt3a的下游分子增強CFC記憶的整合。 為了更好的揭示W(wǎng)nt3a調(diào)控CFC學習記憶的機制,我們通過慢病毒過表達穩(wěn)定存在的ΔN90β-catenin觀察對CFC學習記憶的影響。結(jié)果顯示,過表達active-β-catenin能增強CFC記憶的整合過程而對CFC記憶的獲得沒有影響。而CFC訓練前分別向active-β-catenin過表達小鼠及對照小鼠海馬內(nèi)注射Wnt3a抗體,發(fā)現(xiàn)過表達active-β-catenin糾正Wnt3a抗體引起的CFC LTM的損傷,而對CFC STM沒有影響,進一步確定β-catenin作歲Wnt3a的下游分子特異的增強CFC記憶的整合而對CFC記憶的獲得沒有影響。 結(jié)論： 1.CFC學習記憶訓練能誘導小鼠海馬腦區(qū)中Wnt3a特異性表達增加。 2.CFC學習記憶訓練能引起海馬腦區(qū)Wnt3a的釋放,并且Wnt3a的釋放早于Wnt3a的合成,同時CFC訓練能引起Wnt3a下游信號通路Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信號通路的激活。 3.Wnt3a是CFC記憶形成的必要且充分條件。 4.Wnt/Ca2+及Wnt/β-catenin信號通路分別參與CFC記憶的獲得及整合過程。 5.在海馬腦區(qū)內(nèi)過表達激活型β-catenin能特異性糾正Wnt3a抗體引起的CFC記憶整合的缺陷,而對CFC記憶的獲得沒有影響。 意義： 本課題旨在使我們了解Wnt3a參與CFC學習記憶的神經(jīng)生物學機制,并為將來以Wnt通路為靶標的記憶干預提供新思路和新方法。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：Q42
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本文編號：1690530