本文選題：骨靶向多肽　切入點(diǎn)：成骨活性　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文

【摘要】：第一部分:骨靶向多肽的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究目的:通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)骨靶向多肽的成骨活性方法:采用ALP活性檢測(cè)及染色、RT-PCR、Western Blot檢測(cè)骨靶向多肽促進(jìn)MC3T3-E1成骨分化能力。結(jié)果:1.骨靶向多肽能顯著提高M(jìn)C3T3-E1細(xì)胞的ALP活性(P0.05)。2.骨靶向多肽能顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞ALP、COL-1、RUNX2 m RNA表達(dá)量(P0.05)。3.骨靶向多肽能顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞ALP、COL-1、RUNX2蛋白表達(dá)量(P0.05)。結(jié)論:骨靶向多肽具有較好的成骨活性。第二部分:骨靶向多肽/煅燒骨支架的制備和評(píng)價(jià)目的:研究煅燒骨(TBC)支架的理化性質(zhì)并構(gòu)建骨靶向多肽/TBC支架,評(píng)估骨靶向多肽與TBC在體外的親和性,以及骨靶向多肽/TBC支架中骨靶向多肽的緩釋性能。方法:1.制備煅燒牛松質(zhì)骨,60Co輻照滅菌,通過(guò)X射線(xiàn)光電子能譜(XRD)、傅立葉紅外光譜儀(FTIR)、掃描電鏡(SEM)對(duì)其進(jìn)行表征,分析物相和形貌以及微孔孔徑大小、孔隙率。2.將TBC支架材料(0.5 cm×0.5 cm×0.5cm)為吸附的主要介質(zhì),將其與100ug/ml多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2溶液充分作用10min、20min、30min、60min、90min、120min、150min、180min,BCA(Bicinchonininc acid assay)法測(cè)定上清液中多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2的濃度,繪制吸附曲線(xiàn)。3.以TBC支架材料(0.5 cm×0.5 cm×0.5cm)為吸附的主要介質(zhì),將其與100ug/ml具有熒光標(biāo)記的多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2溶液充分作用120min后,取出后避光于冷凍干燥機(jī)中,12小時(shí)后取出在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。4.將0.5 cm×0.5 cm×0.5cm骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料分別置于無(wú)菌凍存管中,加入2ml無(wú)菌PBS溶液,置于37℃恒溫?fù)u床上持續(xù)振搖。分別在振搖1d,2d,3d,4d,5d,6d,7d,8d,9d,10d,12d,14d,17d,21d,28d后檢測(cè)釋放液中骨靶向多肽、多肽和rh BMP2含量,計(jì)算均值并繪制累計(jì)釋放曲線(xiàn)。結(jié)果:1.TBC主要成分為HA,表面孔隙大小主要分布在220~650μm之間,孔隙率為84.4±0.3%,力學(xué)強(qiáng)度檢測(cè),其極限載荷為65N,極限壓強(qiáng)為2.6Mpa。2.熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)骨靶向多肽在TBC表面吸附較多,顯著高于多肽和rh BMP-2組。吸附曲線(xiàn)提示:多肽、骨靶向多肽及rh BMP-2在30min內(nèi)均能快速地與TBC進(jìn)行吸附,其中多肽和rh BMP-2達(dá)到吸收的峰值。靶向多肽隨著時(shí)間仍呈現(xiàn)升高趨勢(shì),在120min時(shí)達(dá)到頂峰。3.緩釋曲線(xiàn)提示:與多肽與rh BMP-2相比,骨靶向多肽復(fù)合TBC后的釋放時(shí)間延長(zhǎng)。結(jié)論:高溫煅燒的TBC支架保留了天然骨的基本理化特性,具有良好的骨傳導(dǎo)性;骨靶向多肽與TBC支架親和性較強(qiáng),骨靶向多肽復(fù)合TBC后的釋放具有緩釋效果。第三部分:骨靶向多肽/TBC支架生物相容性和骨誘導(dǎo)活性研究目的:研究骨靶向多肽/TBC支架的生物相容性,評(píng)估骨靶向多肽/TBC支架的安全性和骨誘導(dǎo)活性,為其體內(nèi)應(yīng)用提供依據(jù)。方法:1.骨靶向多肽/TBC與無(wú)血清培養(yǎng)基比例為0.2g/ml,密封混合于37°C恒溫箱中,浸提24小時(shí)后制備浸提液,使用100%、75%、50%、25%的浸提液、培養(yǎng)基(陰性對(duì)照組)和0.64%苯酚溶液(陽(yáng)性對(duì)照組)與L929細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后觀察細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞相對(duì)增值率。2.取成年SD大鼠20只,雌雄各半,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)}D和假手術(shù)組,每組各10只,麻醉成功后將0.5cm×0.5cm×0.5cm骨靶向多肽/TBC支架植入皮下組織,術(shù)后觀察大鼠一般情況,術(shù)后將支架及其周?chē)M織完整取出,行HE染色觀察。3.將MC3T3-E1細(xì)胞以1×105/ml濃度均勻接種于靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料表面,培養(yǎng)5天后通過(guò)SEM觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,并利用MTT法測(cè)定支架表面細(xì)胞的ALP活性。4.取SPF級(jí)昆明小鼠8只,雌雄各半,隨機(jī)分為骨靶向多肽/TBC組、多肽/TBC組、rh BMP-2/TBC組、TBC組,每組各2只,麻醉成功后,分別將支架材料植入小鼠股四頭肌肌間隙中,術(shù)后觀察一般情況,4周時(shí)取材,HE染色觀察支架材料周?chē)男鹿切纬汕闆r。結(jié)果:1.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:各浸提液組中的L929細(xì)胞均生長(zhǎng)良好,無(wú)細(xì)胞毒性,細(xì)胞相對(duì)增值率與陰性對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,細(xì)胞毒性分級(jí)為I級(jí)。2.骨靶向多肽/TBC支架植入大鼠皮下12周后的亞慢性毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在大體觀察上未發(fā)現(xiàn)差異,HE染色也未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和壞死。3.SEM觀察發(fā)現(xiàn),MC3T3-E1細(xì)胞在骨靶向多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料表面生長(zhǎng)較好,細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形和多角形,細(xì)胞數(shù)量較多,連接成片,ALP活性也明顯高于多肽/TBC支架材料組和TBC組。4.HE染色提示:TBC組中,在材料周?chē)饕抢w維結(jié)締組織;在骨靶向多肽/TBC支架材料組中,材料中間有大量的新骨形成;在rh BMP-2/TBC支架材料組中,在材料與肌肉接觸的邊緣可見(jiàn)較多的新骨形成。結(jié)論:骨靶向多肽/TBC支架材料無(wú)細(xì)胞毒性,細(xì)胞在其表面生長(zhǎng)良好,具有良好的生物相容性,在肌間隙內(nèi)具有良好的骨誘導(dǎo)活性。第四部分:骨靶向多肽/TBC支架修復(fù)大鼠顱骨缺損研究目的:探討大鼠顱骨缺損模型建立的相關(guān)影響因素,研究骨靶向多肽/TBC支架材料修復(fù)顱骨缺損的可行性和療效。方法:1.游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠顱骨雙側(cè)頂骨的前后徑和橫徑。2.取成年雄性SD大鼠50只,隨機(jī)分為5mm缺損組(40只)和8mm缺損組(10只),其中5mm缺損組根據(jù)是否屏蔽硬腦膜和骨膜,隨機(jī)分為四組:硬腦膜屏蔽組、骨膜屏蔽組、硬腦膜和骨膜均屏蔽組、未處理組。術(shù)后8周和12周取材,通過(guò)影像學(xué)和組織學(xué)對(duì)其骨修復(fù)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。3.在大鼠顱骨缺損模型中,將骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC、TBC支架材料分別植入缺損處,術(shù)后4周和8周取材,行影像學(xué)和組織學(xué)觀察。結(jié)果:1.大鼠顱骨頂骨前后徑為7.44±0.42mm;左右徑為5.13±0.12mm。2.大鼠顱骨缺損(雙側(cè),CSD為5mm)在術(shù)后8周和12周Micro-CT檢測(cè)提示:硬腦膜和骨膜均屏蔽組中,新生骨形成最少,體積百分比(BV/TV×100%)在分別為10.6±3.4%,17.4±5.7%;在未處理組中,缺損修復(fù)較好,新骨形成體積百分比為61.6±7.4%,90.6±4.1%。HE染色觀察發(fā)現(xiàn),在硬腦膜和骨膜均屏蔽組中,缺損處有大量的纖維結(jié)締組織,骨長(zhǎng)入較少;而未處理組中大量新生骨組織生成。3.大鼠顱骨缺損模型中,雙側(cè)5mm和8mm(中央側(cè))在硬腦膜和骨膜均屏蔽時(shí),術(shù)后8周和12周新生骨形成百分比相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在術(shù)中出血量、手術(shù)時(shí)間和死亡率方面,8mm組顯著高于5mm組。4.術(shù)后4周和8周Micro-CT檢測(cè)提示:rh BMP-2/TBC組和骨靶向多肽/TBC中新生骨體積百分比無(wú)顯著差異,均高于多肽/TBC組,而TBC組中的新生骨體積百分比最少。5.術(shù)后4周和8周HE染色觀察發(fā)現(xiàn),TBC組中骨組織長(zhǎng)入較少,在多肽/TBC、骨靶向多肽/TBC、rh BMP-2/TBC組中,骨組織長(zhǎng)入較多,其中靶向多肽/TBC組中在材料周?chē)腿睋p邊緣可見(jiàn)大量的新生骨組織。6.術(shù)后免疫組化染色:4周時(shí)TBC組成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)最弱,多肽組、骨靶向多肽組、rh BMP-2組成骨相關(guān)蛋白表達(dá)依次增強(qiáng);8周時(shí),TBC組ALP表達(dá)增強(qiáng),而多肽組、骨靶向多肽組及rh BMP-2組均有不同程度降低;各組OCN表達(dá)均增強(qiáng),其中骨靶向多肽組與rh BMP-2組OCN表達(dá)最高。結(jié)論:大鼠顱骨缺損模型中,當(dāng)硬腦膜和骨膜均屏蔽時(shí),雙側(cè)5mm缺損在自我修復(fù)能力方面與8mm無(wú)明顯差異,而且并發(fā)癥較少,適合作為一個(gè)骨缺損模型。骨靶向多肽/TBC可以促進(jìn)大鼠顱骨缺損的修復(fù),是一種較理想的皮質(zhì)骨缺損修復(fù)支架材料。第五部分:骨靶向多肽/TBC支架修復(fù)兔股骨髁骨缺損研究目的:探討骨靶向多肽/TBC支架修復(fù)兔股骨髁骨缺損研究的可行性與療效。方法:取成年雄性新西蘭大白兔20只,麻醉成功后,在兔股骨髁外側(cè)利用環(huán)鉆鉆取直徑6mm、高10mm的松質(zhì)骨骨缺損模型,隨機(jī)分別植入TBC、骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC支架材料,每組10只。術(shù)后觀察動(dòng)物一般情況,4周和8周時(shí)取出,將雙側(cè)股骨髁完整取出,行影像學(xué)檢查和組織學(xué)觀察。結(jié)果:1.術(shù)后4周和8周Micro-CT掃描提示:rh BMP-2/TBC組和骨靶向多肽/TBC中新生骨體積百分比無(wú)顯著差異,均高于多肽/TBC組,而TBC組中的新生骨體積百分比最少。2.HE染色觀察發(fā)現(xiàn),TBC中支架材料周?chē)梢?jiàn)少量骨組織長(zhǎng)入,在骨靶向多肽/TBC、多肽/TBC、rh BMP-2/TBC中,骨組織長(zhǎng)入較多。在靶向多肽/TBC、rh BMP-2/TBC組中,材料周?chē)梢?jiàn)少量板狀骨和血管長(zhǎng)入,在材料與宿主交界處可見(jiàn)大量新生骨組織。Lane-Sandhu評(píng)分中,rh BMP-2/TBC組與靶向多肽/TBC組無(wú)明顯差異,顯著高于多肽/TBC組,TBC組評(píng)分最低。Masson染色發(fā)現(xiàn),術(shù)后4周,TBC組出現(xiàn)少量膠原纖維,未見(jiàn)新生骨出現(xiàn);多肽組出現(xiàn)較多膠原纖維,并有少量新生骨生成;骨靶向多肽組中新生骨組織較多。術(shù)后8周,各組中新生骨組織均有不同程度增加,其中骨靶向多肽組中可見(jiàn)大量新生骨組織。結(jié)論:骨靶向多肽/TBC可以促進(jìn)兔股骨髁松質(zhì)骨缺損的修復(fù),是一種理想的松質(zhì)骨骨缺損修復(fù)材料,
[Abstract]:Objective : To investigate the effect of bone - targeting polypeptide on bone - targeting polypeptide ( MC3T3 - E1 ) . Results : 1 . Bone - targeting polypeptide can significantly increase ALP , COL - 1 , RUNX2 mRNA expression levels in MC3T3 - E1 cells ( P0.05 ) . Bone - targeting polypeptide and rh BMP - 2 solution were isolated from freeze - drying machine for 120 min . The bone - targeted polypeptides , polypeptides and rh BMP - 2 were isolated from the freeze - drying machine after 12 hours . Objective : To study the biocompatibility and osteoinductive activity of bone - targeted polypeptide / TBCs scaffold : To study the biocompatibility of bone - targeted polypeptide / TBCs scaffold , to evaluate the safety and osteoinductive activity of bone - targeted polypeptide / TBCs scaffold . Objective : To investigate the effect of bone targeting polypeptide / TBCs on repairing skull defects in rats . The results showed that there was no significant difference in bone tissue length between 8 weeks and 8 weeks after operation , but there was no significant difference in bone tissue length between 8 weeks and 8 weeks after operation . Results : 1 . There was no significant difference in bone volume percentage in bone - targeting polypeptide / TBCs , polypeptides / TBCs and rh BMP - 2 / TBCs . Results : 1 . There was no significant difference in bone tissue in bone - targeting polypeptide / TBCs , polypeptides / TBCs , rh BMP - 2 / TBCs , and there were a lot of new bone tissue in the bone - targeted polypeptide / TBCs . Conclusion : Bone - targeting polypeptide / TBCs can promote the repair of bone defects in rabbits .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R68
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本文編號(hào)：1678355