發(fā)布時(shí)間：2018-03-25 05:37

  本文選題：UPLC-MS/MS　切入點(diǎn)：UPLC-Q-TOF-MS　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文

【摘要】：中藥是在傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下應(yīng)用的天然藥物,連花清瘟膠囊2004年被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)批準(zhǔn)上市,并于2009年被衛(wèi)生部推薦用于治療甲型H1N1流感。近年來的臨床研究顯示連花清瘟膠囊具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)功能,并能抑制慢性阻塞性肺病急性發(fā)作期的氣管炎癥。在治療甲型流感病毒感染改善癥狀方面優(yōu)于達(dá)菲。目前在臨床、藥理研究方面已進(jìn)行了較為深入的研究,但連花清瘟膠囊體內(nèi)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確。UPLC-MS/Q-TOF MS是快速而有效的復(fù)雜樣品分析技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)擬在多組分分析、藥代動(dòng)力學(xué)及排泄動(dòng)力學(xué)研究的基礎(chǔ)上,分析連花清瘟主要活性成分及可能的代謝產(chǎn)物和轉(zhuǎn)化途徑,為其藥理學(xué)研究提供依據(jù)。建立中藥復(fù)方多成分及其代謝物的UPLC-MS-MS、UPLC-Q-TOF-MS分析平臺(tái),完善連花清瘟多組分的體內(nèi)外分析方法。測(cè)定大鼠口服給藥后連花清瘟相關(guān)組分的血藥濃度,根據(jù)藥時(shí)曲線計(jì)算相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù),研究連花清瘟在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)特征,為其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS法進(jìn)行連花清瘟組分連翹苷在大鼠膽汁及尿液中代謝產(chǎn)物的研究,建立連翹苷的體外肝代謝模型,比較體內(nèi)和體外代謝差異,研究連翹苷不同種屬動(dòng)物與人類之間體外代謝差異,為連翹苷生物體內(nèi)過程的進(jìn)一步研究并闡明作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。采用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)測(cè)定大鼠尿液中8個(gè)主要活性成分,進(jìn)行連花清瘟膠囊大鼠體內(nèi)排泄研究,為連花清瘟膠囊的研發(fā)和藥物臨床應(yīng)用的安全性提供依據(jù)。第一部分基于UPLC-MS-MS技術(shù)的連花清瘟膠囊多組分同時(shí)分析目的:建立一種UPLC-MS-MS方法同時(shí)測(cè)定連花清瘟膠囊中8個(gè)活性化合物的含量。方法:取連花清瘟膠囊內(nèi)容物,研勻,精密稱定干膏粉約0.5g,置具塞錐形瓶中,加甲醇100mL,密塞,稱定重量,超聲處理30min,放冷,稱重,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液進(jìn)樣測(cè)定。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(esi源),正負(fù)離子切換掃描模式,毛細(xì)管噴霧電壓為3.5kv,脫溶劑氣溫度為550℃。對(duì)每個(gè)化合物的ce和cv進(jìn)行優(yōu)化,esi一級(jí)全掃描質(zhì)譜準(zhǔn)分子離子峰[m+h]+和二級(jí)全掃描質(zhì)譜子離子分別為:大黃酚m/z253.0#174;225.0;大黃素m/z269.0#174;225.0;大黃酸m/z283.0#174;239.0;蘆薈大黃素m/z269.0#174;240.0;甘草苷m/z417.0#174;255.0;木犀草素m/z287.0#174;153.0;連翹苷m/z578.8#174;370.8;紅景天苷m/z299.0#174;119.0;駐留時(shí)間為0.163secs。液相色譜條件:watersacquityuplc#174;hsst3c18色譜柱(2.1×50mm,1.8μm);流動(dòng)相為乙腈(a)-0.1%甲酸水(b),0.4ml/min梯度洗脫,0~2.5min,a15%-85%,2.5~4.5min,a85%~15%;每次進(jìn)樣前以流動(dòng)相初始條件a15%預(yù)平衡3min;流速400μl/min;柱溫40℃;進(jìn)樣量8μl。結(jié)果:8種化合物在測(cè)定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r20.99;精密度rsd值小于1.73%,表明方法的精密度良好。平均回收率為92.8%~101.8%,rsd值為1.09%~3.79%;供試品溶液在室溫條件下放置12h穩(wěn)定性良好,rsd值小于2.83%。采用uplc-ms-ms方法正負(fù)離子切換掃描7.5min完成一個(gè)分析周期。結(jié)論:方法快速簡(jiǎn)便,靈敏度高,選擇性好,可用于連花清瘟膠囊質(zhì)量控制。第二部分基于uplc-ms-ms技術(shù)的連花清瘟膠囊在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)力學(xué)特征目的:建立同時(shí)測(cè)定大鼠體內(nèi)連花清瘟膠囊組分大黃酸、大黃酚、連翹苷和紅景天苷uplc-ms-ms方法,通過測(cè)定大鼠體內(nèi)血藥濃度建立藥-時(shí)曲線,計(jì)算藥動(dòng)力學(xué)參數(shù),闡明其藥動(dòng)力學(xué)特征。方法:雄性sd大鼠以8.5g/kg劑量灌胃給予連花清瘟混懸溶液,分別于給藥前及給藥后0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、360、420、480、600min,眼眥靜脈叢取血,置肝素化抗凝管中,3500rpm離心10min,取上清液-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆�。血樣樣品處理采用液液萃取�?于0.4ml血漿中依次加入5μl內(nèi)標(biāo)溶液(5μg/ml氯霉素的甲醇溶液),混勻,加入hcl(1mol/l)10μl,混勻,加乙酸乙酯1.5ml,渦流混合2min,離心(16000rpm)10min后,取乙酸乙酯1.5ml,n2吹干,殘留物加甲醇100μl,渦旋1min,離心(16000rpm)10min,0.22μm濾頭過濾進(jìn)行uplc/ms/ms分析。液相色譜條件:watersacquityuplc#174;hsst3c18色譜柱(2.1×50mm,1.8μm);流動(dòng)相為乙腈(a)-0.1%甲酸水(b),梯度洗脫,0~2.5min,a15%-85%,2.5~4.5min,a85%~15%;流速400μl/min;柱溫40℃。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(esi源),負(fù)離子模式,毛細(xì)管噴霧電壓為3.5kv,脫溶劑氣溫度為550℃。測(cè)得樣品中大黃酸、大黃酚、連翹苷和紅景天苷與內(nèi)標(biāo)峰面積之比,由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得血漿中各成分的濃度,獲得血藥濃度-時(shí)間曲線。藥代動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)處理采用das3.0軟件。結(jié)果:大鼠灌胃給予連花清瘟后,血漿中大黃酸、大黃酚、連翹苷、紅景天苷的cmax分別為:1.813、0.336、0.622、0.579μg/ml;tmax分別為:1.6、2.3、1.0、2.4h;t1/2分別為:2.213、3.165、1.512、4.13h;auc0-t分別為:4.36、1.54、1.106、3.229μg/ml·h2;auc0-∞分別為:4.843、1.74、1.202、4.313μg/ml·h2;mrt分別為:3.152、3.37、1.574、4.233h。結(jié)論:首次對(duì)連花清瘟膠囊中大黃酸、大黃酚、連翹苷和紅景天苷的藥代動(dòng)力學(xué)特征及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究,為進(jìn)一步研究連花清瘟膠囊藥理藥效提供依據(jù)。第三部分基于uplc-q-tof-ms技術(shù)的連翹苷在大鼠膽汁、尿液及糞便中的代謝研究目的:建立大鼠體內(nèi)膽汁、尿液中連翹苷定性分析的uplc-q-tof-ms/ms方法,研究大鼠灌胃給予連翹苷后,連翹苷在大鼠體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化,并鑒定其相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。方法:大鼠以10mg·kg-1劑量灌胃給予連翹苷混懸溶液,生物樣品采用液液萃取法加入2倍量(v/v)乙酸乙酯萃取3次。phenomenexkinetexc18色譜柱(100×2.1mm,2.6μm),流動(dòng)相為甲醇(a)-0.1%甲酸水(b),梯度洗脫,0~1min,a5%,1~10min,a5-50%,10~11min,a50%~70%,11~15min,a70%-100%,15~15.5min,a100%-5%,15.5~18min,a5%。流速為400μl/min,柱溫50℃。電噴霧離子源(esi源),正離子和負(fù)離子模式。參數(shù)設(shè)置為:噴霧電壓為(+)5.5kv,(-)4.5kv;離子源溫度為550℃;氣簾氣為25psi;霧化氣(gas1)和加熱氣(gas2)均為55psi;母離子掃描范圍m/z100-1200(滯留時(shí)間250ms),子離子掃描范圍m/z50-1200(滯留時(shí)間100ms);ce分別為(+)45ev和(-)45ev;ces為15ev;dp分別為(+)60ev和(-)60ev。連翹苷及其代謝物通過智能信息關(guān)聯(lián)采集(ida)的采集方法,實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)背景扣除(dbs)以及多重質(zhì)量虧損(mmdf)觸發(fā)tof-ms/ms,結(jié)合metabolitepilottm代謝物鑒定軟件進(jìn)行鑒定。結(jié)果:采用uplc-q-tof-ms法對(duì)大鼠體內(nèi)膽汁、尿液中連翹苷及其代謝物進(jìn)行定性分析,大鼠灌胃給予連翹苷后膽汁、尿液和糞便中共發(fā)現(xiàn)34個(gè)代謝物,包括30個(gè)i相代謝物和4個(gè)ii相代謝物,其中28個(gè)為新的代謝物。uplc-q-tof-ms方法分析大鼠膽汁樣品發(fā)現(xiàn)連翹苷可轉(zhuǎn)化為主要代謝物m26,即經(jīng)脫葡萄糖基團(tuán)、脫水(-h2o)。結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)首次采用uplc-q-tof-ms法對(duì)連翹苷在大鼠體內(nèi)代謝途徑進(jìn)行研究,連翹苷主要的生物轉(zhuǎn)化路徑為水解、氧化和硫酸化。葡萄糖基團(tuán)、甲基基團(tuán)和四氫呋喃環(huán)是主要的代謝位點(diǎn)。這些發(fā)現(xiàn)提高了對(duì)連翹苷代謝及有效形式的認(rèn)識(shí)。第四部分連花清瘟膠囊中指標(biāo)性成分連翹苷體外代謝種屬差異研究目的:采用uplc-q-tof-ms對(duì)大鼠和人肝微粒體體外溫孵樣品進(jìn)行分析,初步探究連翹苷體外代謝種屬差異特征,并比較體內(nèi)與體外代謝的異同。方法:采用nadph-生成系統(tǒng)(由β-nadp、g-6-p、g-6-pd、mgcl2組成),0.1mol/lk2hpo4緩沖液(ph7.4),肝微粒體蛋白1mg/ml,終體積為1ml。將連翹苷與大鼠、人肝微粒體進(jìn)行體外溫孵,使底物濃度為25μg/ml,甲醇終濃度為0.5%,溫孵液37℃預(yù)熱5min后,向反應(yīng)體系中加入nadph還原系統(tǒng)啟動(dòng)反應(yīng)。37℃恒溫振蕩(150r/min)1h,將反應(yīng)體系取出,立即放入-20℃冰箱終止反應(yīng),每個(gè)樣品平行溫孵3次。樣品處理采用液液萃取法,分別加入乙酸乙酯3ml萃取兩次。合并有機(jī)相40℃n2吹干,殘留物用甲醇200μl超聲5min復(fù)溶后離心(14000r/min)10min,進(jìn)樣分析。應(yīng)用uplc-q-tof-ms技術(shù)對(duì)生物樣品進(jìn)行分析,結(jié)合前期體內(nèi)研究中已經(jīng)進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證的代謝產(chǎn)物,通過比較保留時(shí)間和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息推測(cè)所測(cè)得代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果:通過與空白樣品比較,在大鼠、人肝微粒體檢測(cè)并鑒定了16個(gè)不同結(jié)構(gòu)代謝物。檢測(cè)到6個(gè)代謝物與大鼠膽汁中檢測(cè)到的代謝物一致,其余10個(gè)為體外發(fā)現(xiàn)新的代謝物。連翹苷大鼠、人肝微粒體溫孵樣品代謝途徑主要包括水解、氧化、脫甲基反應(yīng)。相似性指數(shù)(si=0.952)表明連翹苷在大鼠和人肝微粒體中代謝非常相似。結(jié)果表明uplc-q-tof-ms法結(jié)合累積分布函數(shù)(cdf)是評(píng)價(jià)連翹苷代謝種屬差異有效的方法。結(jié)論:連翹苷體外肝微粒代謝研究表明兩個(gè)種屬的Ⅰ相代謝產(chǎn)物相似,大鼠與人幾乎無種屬差異。本研究提供了連翹苷全面的體內(nèi)和體外代謝譜,并可用于預(yù)測(cè)人體代謝研究。第五部分基于uplc-ms-ms技術(shù)的連花清瘟膠囊在大鼠體內(nèi)的排泄研究目的:建立大鼠膽汁、尿液中大黃酚、大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、甘草苷、連翹苷、木犀草素、紅景天苷定量分析的uplc-ms-ms方法,研究經(jīng)膽汁和尿液排泄動(dòng)力學(xué)過程,探討其在大鼠體內(nèi)的排泄動(dòng)力學(xué)規(guī)律,為連花清瘟膠囊的研發(fā)和藥物臨床應(yīng)用的安全性提供依據(jù)。方法:大鼠2%戊巴比妥鈉麻醉后行膽管插管術(shù),待動(dòng)物完全清醒后給予連花清瘟混懸液。分別于0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-24、24-36h收集膽汁樣品。大鼠給藥后0-2、2-4、4-6、6-8、8-10、10-12、12-36h收集尿液樣品。樣品預(yù)處理采用一步沉淀蛋白法。采用watersacquityuplc#174;hsst3c18色譜柱(2.1×50mm,1.8μm),流動(dòng)相為乙腈(a)-0.1%甲酸水(b),梯度洗脫,0~2.5min,a15%-85%,2.5~4.5min,a85%~15%,4.5~7.5min,a15%,流速為400μl/min,電噴霧離子源(esi源),正/負(fù)離子模式。結(jié)果:采用esi離子源,mrm正/負(fù)離子切換掃描模式完成檢測(cè)和定量分析。對(duì)定量方法進(jìn)行優(yōu)化整個(gè)運(yùn)行時(shí)間為7.5min。完整的定量方法學(xué)驗(yàn)證顯示方法的線性和專屬性良好。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示該方法簡(jiǎn)單、快速、專屬性強(qiáng)。大鼠灌胃給予連花清瘟混懸液后8個(gè)待測(cè)化合物均可在大鼠尿液中檢測(cè)到,膽汁中可檢測(cè)到5個(gè)待測(cè)化合物。8個(gè)待測(cè)物在尿液中12h內(nèi)累計(jì)排泄量達(dá)到最大值,之后趨于恒定。大黃酸、大黃酚和蘆薈大黃素尿液排泄率分別為78.0%、43.9%和37.0%,證實(shí)尿液為主要的排泄消除途徑。連翹苷、甘草苷、大黃素、木犀草素和紅景天苷尿液排泄率較低,可能存在其他消除途徑或廣泛代謝消除。大黃酸、大黃酚、大黃素、連翹苷和紅景天苷膽汁排泄均較低,小于4.25%。結(jié)論:所建立的方法可用于大鼠給予連花清瘟膠囊后8種主要成分在大鼠尿液排泄研究,連花清瘟膠囊的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究為其藥理機(jī)制研究提供依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1661798