本文選題：七氟烷　切入點(diǎn)：學(xué)習(xí)　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：全身麻醉藥是否會(huì)對(duì)手術(shù)患者的學(xué)習(xí)記憶產(chǎn)生不利影響一直是學(xué)者關(guān)注的問題。在臨床中工作中也確實(shí)發(fā)現(xiàn)有部分病人手術(shù)后會(huì)出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction, POCD),研究證實(shí)POCD的發(fā)生與麻醉用藥或手術(shù)方式之間有一定的相關(guān)性,而不同的全身麻醉藥或不同麻醉方法都有可能對(duì)學(xué)習(xí)記憶功能產(chǎn)生損傷作用。因此,研究麻醉藥物對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響在臨床工作中有著重要意義,值得深入研究。七氟烷是目前在臨床上應(yīng)用非常廣泛的吸入全身麻醉藥。已有研究報(bào)道七氟烷能導(dǎo)致患者手術(shù)后發(fā)生POCD;對(duì)中國人群而言,七氟烷是誘發(fā)非冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)患者發(fā)生POCD的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。有關(guān)吸入麻醉藥七氟烷導(dǎo)致機(jī)體學(xué)習(xí)記憶功能減退的研究已越來越引起人們的重視,近年關(guān)于七氟烷對(duì)學(xué)習(xí)記憶影響的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)報(bào)道不少,但結(jié)果并無定論；多數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為七氟烷對(duì)幼年至老年動(dòng)物均可造成記憶損傷；但在另一方面,也有不少文獻(xiàn)報(bào)道七氟烷對(duì)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶無明顯損傷,甚至還有增強(qiáng)記憶的作用。本研究將從行為學(xué),電生理學(xué)和分子生物學(xué)等多角度觀察七氟烷致大鼠行為學(xué)改變與海馬突觸可塑性和相關(guān)蛋白表達(dá)的聯(lián)系,探討七氟烷致大鼠學(xué)習(xí)記憶損傷的可能機(jī)制,為臨床精心選擇麻醉藥提供指導(dǎo),以減少POCD的發(fā)生。第一部分七氟烷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶行為的影響目的：觀察吸入不同濃度七氟烷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷作用。方法：SD雄性大鼠32只,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、1.5%七氟烷組(Sevol組)、2.4%七氟烷組(Sevo2組)、3.0%七氟烷組(Sevo3組)4組,每組8只。Sevo各組大鼠置于麻醉箱中進(jìn)行麻醉,七氟烷濃度分別穩(wěn)定于1.5%(Sevol組)、2.4%(Sevo2組)或3.0%(Sevo3組),麻醉時(shí)間均為2h。各組在麻醉結(jié)束后24h分別進(jìn)行Y型迷宮、水迷路測(cè)試和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn),并測(cè)定相關(guān)行為學(xué)指標(biāo)。結(jié)果：(1)各組大鼠Sp02和心率均在正常范圍內(nèi),各組相比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)Y型迷宮測(cè)試結(jié)果顯示：吸入七氟烷后各組達(dá)標(biāo)所需時(shí)間逐漸延長,訓(xùn)練次數(shù)增加；與Control組相比較,Sevol組、Sevo2組和Sevo3組的達(dá)標(biāo)時(shí)間均顯著延長(P0.01),而Sevo2組(P0.05)和Sevo3組(P0.01)的訓(xùn)練次數(shù)顯著增加。(3)在水迷路測(cè)試中,隨著吸入七氟烷濃度的增加,大鼠找到臺(tái)階的潛伏期時(shí)間明顯延長,同時(shí)進(jìn)入盲端的錯(cuò)誤次數(shù)明顯增加；其中Sevo2組和Sevo3組的潛伏期時(shí)間和錯(cuò)誤次數(shù)與Control組相比較均顯著增加(P0.01)。(4)曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隨著吸入七氟烷濃度的增加,大鼠在中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間延長,站立次數(shù)下降；其中Sevo2組和Sevo3組的中央?yún)^(qū)活動(dòng)時(shí)間與Control組相比較均顯著增加(P0.01),而Sevo3組(P0.05)的大鼠站立次數(shù)與Control組相比較顯著減少。結(jié)論：(1)吸入七氟烷2小時(shí)后對(duì)大鼠的學(xué)習(xí)記憶有損傷作用。(2)隨著濃度的升高,七氟烷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶的損傷作用逐漸增加,在高濃度時(shí)損傷作用明顯。第二部分 七氟烷對(duì)離體大鼠海馬腦片突觸可塑性的影響目的：在離體海馬腦片上采用細(xì)胞外電生理記錄技術(shù),觀察七氟烷對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)突觸可塑性的影響。方法：SD雄性大鼠斷頭取腦,制備離體海馬腦片,在CA1區(qū)錐體細(xì)胞層記錄電刺激誘發(fā)的群峰電位(Population spike, PS)。觀察3%七氟烷對(duì)突觸基礎(chǔ)傳遞(PS)、雙脈沖抑制(Paired pulse depression, PPD).. NMDA受體依賴型長時(shí)程抑制(NMDAR-LTD).代謝性谷氨酸受體依賴型長時(shí)程抑制(mGluR-LTD)以及分別使用NMDA受體谷氨酸位點(diǎn)拮抗劑2-氨基-5-磷酰基戊酸酯(D-2-amino-5-phosphonovaleric-acid, APV)和GABAA受體拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline methiodide, BMI)后的變化。結(jié)果：(1)七氟烷對(duì)突觸基礎(chǔ)傳遞的影響：Sevo組(P0.01)與Control組相比較,七氟烷使海馬腦片PS幅值顯著下降,Sevo組的輸入-輸出值(I/O)趨勢(shì)整體向下移動(dòng)；Sevo+BMI組(P0.01)和Sevo組相比較,PS幅值顯著升高,Sevo+BMI組(P0.01)與BMI組相比較,PS幅值顯著下降,BMI可部分減輕七氟烷對(duì)PS幅值的抑制作用。(2)七氟烷對(duì)PPD的影響：Sevo組(P0.01)與Control組相比較,七氟烷可以使海馬腦片P2/P1比值顯著增大。BMI 10μmol/L可部分減弱七氟烷對(duì)P2/P1比值增大作用。隨著ACSF灌流液中Ca2+濃度的升高,P2/P1比值逐漸減小,對(duì)PPD有易化作用。在不同Ca2+濃度ACSF中,七氟烷使P2/P1比值明顯增大,有減弱PPD的作用。(3)七氟烷對(duì)NMDAR-LTD的影響：NMDAR-LTD由低頻刺激LFS(900個(gè)脈沖刺激,1Hz)誘導(dǎo)發(fā)生。Sevo組(P0.01)和Control組相比較,七氟烷可使LFS刺激后PS幅值顯著下降；而在Sevo+APV組中,APV可完全阻斷LFS對(duì)LTD的誘發(fā)作用。Ca2+螯合劑BAPTA0.5μmol/L明顯抑制七氟烷對(duì)LTD的易化作用。(4)七氟烷對(duì)mGluR-LTD的影響：mGluR-LTD由mG1uR2/3激動(dòng)劑LY354740誘發(fā)；七氟烷對(duì)LY354740引起的PS幅值降低無明顯影響,Sevo+ LY354740組(P0.05)和LY354740組相比較,PS幅值無明顯變化。結(jié)論：(1)七氟烷使海馬腦片PS的幅值明顯下降,同時(shí)輸入-輸出值(I/O)趨勢(shì)整體向下移動(dòng),對(duì)Schaffer側(cè)枝CA1錐體細(xì)胞的突觸傳遞有抑制作用。(2)七氟烷使海馬腦片PPD的P2/P1比值明顯升高,抑制突觸前傳遞,其作用與細(xì)胞外Ca2+濃度變化有關(guān),GABA受體拮抗劑BMI不能完全取消其對(duì)PPD的抑制作用。(3)七氟烷易化海馬NMDAR-LTD,降低海馬突觸傳遞效能,其作用與細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化有關(guān)。(4)七氟烷對(duì)mGluR2/3-LTD無明顯作用。第三部分 七氟烷影響大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的分子機(jī)制目的：采用分子生物學(xué)方法,探討七氟烷損傷大鼠學(xué)習(xí)記憶時(shí)海馬突觸前相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。方法：SD雄性大鼠32只,隨機(jī)分為對(duì)照組(Control組)、1.5%七氟烷組(Sevol組)、2.4%七氟烷組(Sevo2組)、3.0%七氟烷組(Sevo3組)4組,每組8只。各組在麻醉結(jié)束后24h分別進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試,結(jié)束后即刻斷頭取腦,分離雙側(cè)海馬取組織進(jìn)行Western Blot檢測(cè),分析突觸前相關(guān)蛋白Sytl和Syt4、mGluR2及BDNF/TrkB信號(hào)傳導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的變化。結(jié)果：(1)行為學(xué)結(jié)果見第一部分。(2)隨著吸入七氟烷濃度的增加,Syrtl蛋白表達(dá)逐漸降低,Syt4蛋白表達(dá)逐漸升高；其中Sevo2組(P0.01)和Sevo3組(P0.01)的Sytl蛋白表達(dá)與Control組相比較顯著減少；Sevol組(P0.05)、Sevo2組(P0.01)和Sevo3組(P0.01)的Syt4蛋白表達(dá)與Control組相比較顯著增加。(2) Sevol組、Sevo2組和Sevo3組與Control組相比較,吸入七氟烷后mGluR2表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)隨著吸入七氟烷濃度的增加,BDNF、 TrkB和p-TrkB表達(dá)均逐漸降低；其中Sevol組(P0.05)、Sevo2組(P0.01)和Sevo3組(P0.01)的BDNF表達(dá)與Control組相比較顯著減少；Sevo2組(P0.01)和Sevo3組(P0.01)的TrkB和p-TrkB表達(dá)與Control組相比較顯著減少。結(jié)論：(1)七氟烷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與減低Sytl表達(dá)和增加Syt4表達(dá)有關(guān),2.4%和3%七氟烷作用明顯。(2)七氟烷對(duì)mGluR2的表達(dá)無明顯影響。(3)七氟烷對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響與抑制BDNF/TrκB信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān),七氟烷減低BDNF、TrκB和p-TrκB表達(dá),2.4%和3%七氟烷作用較明顯。第四部分 七氟烷識(shí)別突觸結(jié)合蛋白1結(jié)合位點(diǎn)的模擬研究目的：采用現(xiàn)代生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行數(shù)據(jù)模擬,分析七氟烷在sytl結(jié)構(gòu)域的具體結(jié)合位點(diǎn)。方法：(1)運(yùn)用FTMap方法來預(yù)測(cè)Sytl結(jié)構(gòu)域上的配體結(jié)合位點(diǎn)。(2)運(yùn)用CORINA程序?qū)⑵叻槎S結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換成三維構(gòu)象。(3)使用UCSFDOCK6分子對(duì)接程序,將七氟烷三維分子與預(yù)測(cè)Sytl的配體結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)接,獲得“Sytl結(jié)構(gòu)域-七氟烷復(fù)合物”。(4)運(yùn)用AMBER11軟件包中的AMBER10力場(chǎng)對(duì)“Sytl C結(jié)構(gòu)域-七氟烷復(fù)合物”進(jìn)行分子動(dòng)態(tài)(MD)模擬實(shí)驗(yàn)。結(jié)果：Sytl C2A結(jié)構(gòu)可能為七氟烷結(jié)合區(qū)域,這一區(qū)域有6個(gè)潛在的口袋與七氟烷對(duì)接,口袋2、3和6與七氟烷親和力最強(qiáng)。其中口袋3最有可能,其親和力測(cè)得值Kd(解離常數(shù))= 12.6 μmol/L。對(duì)七氟烷與口袋3結(jié)合模式分析表明,口袋3中Leu185和Lys190號(hào)殘基可以與七氟烷形成兩個(gè)強(qiáng)氫鍵,Asp188殘基可以與七氟烷形成一個(gè)較弱的鹵鍵,這些化學(xué)鍵賦予了該復(fù)合物較高的穩(wěn)定性。結(jié)論：七氟烷與Sytl C2A區(qū)域存在特異性結(jié)合位點(diǎn),七氟烷可作用于這一特殊位點(diǎn)發(fā)揮藥理學(xué)作用。
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【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R614

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1 楊小霖;Edmond Eger;Manohar Sharma;;七氟烷在小鼠中的代謝研究[J];四川醫(yī)學(xué);2012年11期

2 李麗;呂國義;鄧^，

本文編號(hào)：1633482