本文選題：臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：血管生成素1　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景急性肺損傷(acute lung injury, ALI)是由各種非心源性因素引起的進(jìn)行性加重的呼吸困難、頑固性低氧血癥和肺水腫,病理特征是肺泡-毛細(xì)血管屏障損傷、通透性增加,通氣/血流比例失調(diào)致呼吸衰竭,演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS),在ALI/ARDS中,脂多糖(Lipopolysac charide, LPS)對(duì)微血管內(nèi)皮的直接損傷作用和間接作用都起重要作用,是多種炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子參與,大量多形核中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)激活,釋放大量炎性細(xì)胞因子。盡管目前已在ALI/ARDS改善癥狀、控制病死率等藥物研究方面有諸多進(jìn)展,但死亡率仍高達(dá)40-60%,因此,尋找新的有效治療策略,促進(jìn)ALI/ARDS損傷的修復(fù)仍是亟待解決的課題。除引起ALI外LPS可誘發(fā)內(nèi)毒素血癥,造成感染性休克、多器官損害及功能衰竭,而心臟是內(nèi)毒素血癥時(shí)最常受累器官之一,但內(nèi)毒素血癥心肌損傷及心功能不全的機(jī)制并不十分清楚。炎癥與細(xì)胞凋亡為感染性休克的重要特征,在所有感染性休克發(fā)生過(guò)程中,大約有40%的患者往往伴有不同程度的心功能不全。雖然細(xì)菌可被免疫系統(tǒng)或有效的抗生素殺滅,但休克狀態(tài)并不一定能得到有效的改善。LPS釋放入血后,可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1β等炎性因子,并誘發(fā)細(xì)胞凋亡。間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells, MSCs)是潛在多能的一類細(xì)胞,缺乏特定的細(xì)胞標(biāo)記系它們的體內(nèi)特征。MSCs或MSCs樣細(xì)胞可源于骨髓、脂肪、臍帶血、胎盤組織、肌腱和骨骼肌,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells, BM-MSCs)有旁分泌、免疫調(diào)節(jié)和多向分化的特征,在免疫性疾病治療、創(chuàng)傷后的修復(fù)以及組織的再生等過(guò)程中有積極的作用,BM-MSCs具有調(diào)節(jié)免疫、抑制細(xì)胞凋亡、對(duì)抗炎癥等作用,既往文獻(xiàn)報(bào)道可通過(guò)減輕內(nèi)毒素誘發(fā)的ALI來(lái)改善肺功能。BM-MSCs移植治療心肌梗死大鼠模型的實(shí)驗(yàn),能顯著減低動(dòng)物模型死亡率、縮小梗死面積且心功能恢復(fù)更好。然而,較BM-MSCs相比,臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells,UC-MSCs)更有易提取、細(xì)胞量大、增殖率高等優(yōu)點(diǎn)。血管生成素(Angiopoietin, Ang)是一組分泌型內(nèi)皮細(xì)胞特異性生長(zhǎng)因子,在血管生成、胚胎發(fā)育及創(chuàng)傷修復(fù)等起重要作用,Ang1表達(dá)于不同細(xì)胞,包括血管周細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨核細(xì)胞等,可減輕炎癥反應(yīng)、抑制細(xì)胞凋亡及降低血管通透性,維持肺泡毛細(xì)血管膜穩(wěn)定而在ALI中發(fā)揮作用,Ang1修飾BM-MSCs后可與MSCs發(fā)揮協(xié)同作用,在抗炎及穩(wěn)定血管內(nèi)膜、減輕血管滲漏方面發(fā)揮了更強(qiáng)的作用。但目前尚無(wú)應(yīng)用Ang1基因修飾的人UC-MSCs治療ALI的相關(guān)報(bào)道。且有關(guān)于人UC-MSCs-Angl干預(yù)LPS誘發(fā)的心肌損傷及心功能影響的研究,目前尚未有報(bào)道。因此,本研究以UC-MSCs作為載體,利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)使其攜帶并高表達(dá)Ang1基因,增強(qiáng)UC-MSCs的作用。應(yīng)用UC-MSCs-Ang1植入大鼠ALI模型后,觀察UC-MSCs與UC-MSCs-Ang對(duì)ALI大鼠的抗炎修復(fù)作用、減輕肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)干細(xì)胞在肺組織的存活,提高ALI大鼠的存活率；研究UC-MSCs-Ang1抑制LPS誘導(dǎo)的心肌損傷炎癥反應(yīng)與心肌細(xì)胞凋亡、改善心肌損傷后心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響,為膿毒血癥急性心肺損傷的細(xì)胞及基因治療提供新的理論依據(jù)。研究目的1.人UC-MSCs分離、培養(yǎng)與鑒定；構(gòu)建攜帶GFP和Ang1基因的慢病毒載體后轉(zhuǎn)染UC-MSCs,并檢測(cè)Ang1在轉(zhuǎn)染UC-MSCs中的表達(dá)情況。2.建立UC-MSCs-Ang1治療LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI實(shí)驗(yàn)方法；觀察Angl基因轉(zhuǎn)染后促進(jìn)UC-MSCs對(duì)LPS所致肺損傷、肺水腫、全身炎癥反應(yīng)、細(xì)胞植入率、生存率等的改善作用。3.觀察UC-MSCs-Ang1抑制LPS誘導(dǎo)的心肌損傷炎癥反應(yīng)與心肌細(xì)胞凋亡；研究UC-MSCs-Ang1對(duì)LPS誘導(dǎo)心肌損傷后心臟結(jié)構(gòu)與功能的影響,為其在心血管疾病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。研究方法一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及Ang1基因修飾UC-MSCs的獲得1. UC-MSCs的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增無(wú)菌條件下將臍帶組織塊采用貼壁法培養(yǎng)原代纖維樣細(xì)胞,以后傳代培養(yǎng)獲得純化的UC-MSCs,5代以后細(xì)胞用來(lái)后續(xù)試驗(yàn)。2. UC-MSCs的形態(tài)及免疫表型檢測(cè)通過(guò)倒置顯微鏡及HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)。使用流式細(xì)胞儀鑒定CD44、CD45、 CD29、CD31,CD34、CD133、CD90、CD105等細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)的表達(dá)。3. UC-MSCs誘導(dǎo)分化能力的鑒定第5代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的MSCs,在約60%融合時(shí),分別加入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基、脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基,2周后進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)染色鑒定。4.Ang1基因的獲取與克隆4.1 Angl引物的設(shè)計(jì)：在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索查詢?nèi)搜苌伤?(NM＿001146)全長(zhǎng)mRNA序列,設(shè)計(jì)兩端帶有BamH1和Sal I酶切位點(diǎn)的引物。4.2 RT-PCR擴(kuò)增：取正常新鮮人臍帶MSCs,采用Trizol方法提取總RNA,以設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增人Angl cDNA。Trizol法提取肺組織總RNA,RT-PCR技術(shù)檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平。4.3克隆載體的構(gòu)建：以T4DNA連接酶將PCR產(chǎn)物與TOPO TA克隆載體連接,將Ang1轉(zhuǎn)入TOPO載體,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)藍(lán)白斑篩選,挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)增并提取質(zhì)粒DNA,雙酶切及測(cè)序驗(yàn)證。5.含有Ang1基因的慢病毒包裝、收獲及轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定6.攜帶GFP和Ang1基因的慢病毒感染UC-MSCs后,熒光顯微鏡觀察熒光表達(dá)；轉(zhuǎn)染72小時(shí)后流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)MSCs中GFP表達(dá)、Western-Blot檢測(cè)MSCs中Ang1蛋白表達(dá)。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。二、血管生成素1修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷1.LPS誘導(dǎo)大鼠急性肺損傷模型的建立與分組選擇SD大鼠125只,隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、LPS組、Fibroblast組、空載MSCs組、MSCs-Ang1組,按照10mg/kg體重腹腔內(nèi)注射LPS,制造急性肺損傷模型,LPS誘導(dǎo)大鼠ALI之后2h開(kāi)始體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn),空載MSCs組尾靜脈注射含5×105空載MSCs的生理鹽水0.3ml, Fibroblast組尾靜脈注射含5×105人成纖維細(xì)胞(MRC-5細(xì)胞系)的生理鹽水0.3ml, MSCs-Angl組尾靜脈注射含5×105MSCs-Angl的生理鹽水0.3ml其余兩組注射等量生理鹽水。2.分別于造模后6h、24h、48h、8d、5d每組處死3-5只大鼠,收集血清、肺組織,進(jìn)行常規(guī)病理切片、支氣管肺泡灌洗液等標(biāo)本。3.檢測(cè)肺組織濕干重比、支氣管肺泡灌洗液中中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及肺組織髓過(guò)氧化物酶活性的檢測(cè)、HE染色觀察肺組織的病理改變及肺損傷嚴(yán)重程度病理評(píng)分。4. ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、TGF-β1、IL-6、IL-10的蛋白含量。5.MSCs-Ang1在損傷肺組織的遷徙和植入的檢測(cè)熒光顯微鏡檢測(cè)GFP+細(xì)胞評(píng)估肺組織中外源性MSCs-Ang1細(xì)胞在肺組織的分布及植入率。RT-PCR檢測(cè)GFP mRNA表達(dá)評(píng)價(jià)外源性MSCs-Ang1細(xì)胞在肺組織的植入情況。6.生存分析5組健康SD大鼠(每組10只)用于生存實(shí)驗(yàn),計(jì)算生存率并繪制生存曲線。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。三、血管生成素1修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠左室心肌重塑與功能1.心電圖在造模后6h、24h、48h、8d、15d描記肢體導(dǎo)聯(lián)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF)心電圖,觀察各組大鼠心臟電活動(dòng)情況并記錄。2.超聲心動(dòng)圖分別在不同時(shí)間點(diǎn),行心臟超聲測(cè)定：左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、左室短軸縮短率(FS)以及射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。3. Millar導(dǎo)管檢測(cè)心功能參數(shù)處死大鼠之前,麻醉后,于左心尖部用注射器10ml的針頭,插入Milllar導(dǎo)管電極,獲得心血管相關(guān)參數(shù),左室舒張末壓(LVEDP)、左室收縮壓(LVSP),左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dt)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt),導(dǎo)出數(shù)據(jù)、分析資料。4.血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)分別在不同時(shí)間點(diǎn)處死大鼠后收集血清,ELISA方法測(cè)血清學(xué)cTnI、 NT-proBNP.5.病理學(xué)檢測(cè)心肌處死動(dòng)物后取心肌組織石蠟包埋切片常規(guī)HE染色,及透射電鏡觀察。石蠟切片行免疫組化法檢測(cè)凋亡細(xì)胞百分比數(shù)、左室心肌組織TNF-α、IL-6和RIP3的表達(dá)。6.實(shí)時(shí)定量RT-PCR基因水平檢測(cè)Trizol法提取心肌組織總RNA, RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TNF-α、IL-6、RIP3和Caspase-3 mRNA表達(dá)水平。RT-PCR檢測(cè)GFP mRNA表達(dá)評(píng)價(jià)外源性MSCs-Angl細(xì)胞在心肌組織的植入情況。7. Western Blot檢測(cè)提取總蛋白,Western-Blot檢測(cè)左室心肌組織內(nèi)炎性因子TNF-α, IL-6,凋亡相關(guān)RIP3、Cleaved Caspase-3和Caspase-3蛋白表達(dá)。8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所用數(shù)據(jù)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。研究結(jié)果一、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性及Angl基因修飾UC-MSCs的獲得1.培養(yǎng)、鑒定MSCs人類臍帶血中,MSCs大量擴(kuò)增,形態(tài)成纖維細(xì)胞樣,經(jīng)流式細(xì)胞儀,分析表明臍帶MSCs可表達(dá)CD29、CD90及CD105,不表達(dá)CD31、CD45、CD34、CD133；2.誘導(dǎo)分化及鑒定誘導(dǎo)1周后,向脂肪細(xì)胞分化的MSCs油紅O染色陽(yáng)性,見(jiàn)有脂滴形成;誘導(dǎo)2周后,ALP染色(+),茜素紅染色提示細(xì)胞內(nèi)鈣沉積；原本梭形的MSCs呈現(xiàn)變寬平,逐漸分化為成骨細(xì)胞。3.慢病毒表達(dá)載體的收獲及轉(zhuǎn)染效率經(jīng)酶切將Ang1基因序列經(jīng)克隆入慢病毒-載體pGC-LV-GV287-GFP,將pGC-LV-GV287-GFP-Angl及兩元件pHelper 1.0、pHelper 2.0分別提取、重組質(zhì)粒,共轉(zhuǎn)染、包裝293T細(xì)胞,獲得pGC-LV-GV287-GFP-Ang1,經(jīng)超速離心濃縮法后,取到濃縮液。按梯度法稀釋后,再熒光滴度法,測(cè)滴度2×108TU/ml,接種后加入實(shí)驗(yàn)組感染復(fù)數(shù)為8的pGC-LV-GV287-GFP-Angl,并設(shè)pGC-LV-GV287-GFP空載作為對(duì)照以鑒定。移去病毒懸液后GFP于第24小時(shí)開(kāi)始表達(dá),細(xì)胞內(nèi)可觀察到明顯的熒光,轉(zhuǎn)染36h后收集細(xì)胞進(jìn)行Western-Blot檢測(cè)目的蛋白表達(dá),可以觀察到57KD附近處有特征條帶。4.收獲Angl基因修飾的UC-MSCs以攜帶GFP報(bào)告基因和Ang1基因的慢病毒載體轉(zhuǎn)染MSCs,通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)評(píng)估轉(zhuǎn)染率,第72小時(shí)表達(dá)最顯著為約95%或更高,通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞率97.4%,同時(shí)經(jīng)Western-Blot檢測(cè)分析Ang1的表達(dá),于轉(zhuǎn)染72小時(shí)可見(jiàn)Ang1蛋白顯著表達(dá)(P0.05)。二、Angl修飾人UC-MSCs減輕脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷1.ALI后肺組織病理學(xué)變化及肺損傷評(píng)分腹腔注射LPS 6h后,肺組織病理HE染色表現(xiàn)為明顯的毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,中性粒細(xì)胞明顯增多、滲出,并于48h達(dá)到高峰,同時(shí)出現(xiàn)一些小的膿腫及肺大皰。在LPS注射后的各個(gè)時(shí)間點(diǎn),MSCs組和MSCs-Angl組肺損傷評(píng)分均降低(P0.05),其中第24h、48h、8d時(shí)MSCs-Angl組的肺損傷評(píng)分顯著低于MSCs組(P0.05)。Fibroblast注射組沒(méi)有改善病理形態(tài)學(xué)和肺損傷評(píng)分。2.支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞數(shù)量及肺組織MPO活性于24h和48h MSCs-Angl組與MSCs組相比,支氣管肺泡灌洗液中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著減少(P0.01-0.05),在第8d、15d MSCs-Angl組的中性粒細(xì)胞數(shù)接近正常對(duì)照組。同時(shí),造模24h之后,MSCs-Angl組與MSCs相比MPO活性均明顯降低(P0.05)。3.肺組織濕干重比LPS組肺組織濕干重比升高(P0.05),在ALI造模48h、8d, MSCs-Angl組與MSCs相比肺組織濕干比明顯降低(P0.01-0.05)。4. ELLISA檢測(cè)細(xì)胞因子促炎介質(zhì)TNF-α、IL-6、TGF-β1的血清濃度的升高,證實(shí)了LPS造成了顯著的急性全身性炎癥反應(yīng)。MSCs-Angl的植入減輕了這些炎癥因子的升高(P0.01-0.05)。 LPS同樣引起各時(shí)間段抗炎因子IL-10血漿濃度的升高,在24h、48h與MSCs組相比,MSCs-Ang1組IL-10濃度顯著升高(P0.01-0.05)5. MSCs-Angl在損傷肺組織的遷徙和植入的檢測(cè)熒光顯微鏡觀察移植后第8d, GFP+細(xì)胞在MSCs-Ang1組肺組織切片中陽(yáng)性率大于MSCs組。此外,肺損傷嚴(yán)重的區(qū)域GFP+細(xì)胞的數(shù)量高于損傷輕的區(qū)域(P0.05)。經(jīng)RT-PCR檢測(cè)ALI后第8d MSCs-Angl組表達(dá)GFP mRNA高于空載MSCs組(P0.05),LPS組及Fibroblast組幾乎沒(méi)有GFP mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染的外源性Ang1促進(jìn)MSCs的植入和存活。6.生存分析MSCs-Ang1治療組15d生存率明顯高于單純MSCs組,分別為70%和50%(P0.05)。三、Angl修飾人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞改善脂多糖誘導(dǎo)的大鼠左室心肌重塑1.心電圖LPS組部分心電圖異常表現(xiàn),可見(jiàn)QRS波形電交替、心動(dòng)過(guò)速、心動(dòng)過(guò)緩等各種復(fù)雜心律失常；MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后,未見(jiàn)明顯復(fù)雜心律失常減少,提示MSCs-Ang1可部分改善心電活動(dòng)。2.超聲心動(dòng)圖左心結(jié)構(gòu)的改變左心腔室大小,實(shí)驗(yàn)初,各組之間LVIDs及LVIDd均無(wú)顯著性差異(P0.05)；實(shí)驗(yàn)15d,LPS組與對(duì)照組比較,LVIDd均擴(kuò)大(P0.05)；與LPS組比較,MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)組LVIDd均減小,MSCs-Ang1干預(yù)組減小(P0.05)；左心收縮功能改變實(shí)驗(yàn)初,各組大鼠間FS和LVEF的變化均無(wú)顯著差異(P0.05)。實(shí)驗(yàn)15d,LPS組與對(duì)照組比較,FS、LVEF均不同程度降低(P0.01-0.05)；與LPS組比較,MSCs與MSCs-Angl干預(yù)組FS、LVEF均不同程度升高,MSCs-Angl干預(yù)組明顯改善(P0.01-0.05)。3. Millar導(dǎo)管測(cè)左心功能實(shí)驗(yàn)?zāi)?與對(duì)照組比較,LPS組LVSP明顯下降(P0.01)、LVEDP升高(P0.01)、±dp/dt max絕對(duì)值降低(P0.01-0.05),48h-8d小時(shí)均明顯；與LPS組比較,MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后的兩組,LVSP在MSCs-Angel干預(yù)后升高明顯(P0.05),+dp/dt max (mmHg/s)均升高(P0.05)。與LPS組比較,兩干預(yù)組LVEDP均不同程度下降(P0.01-0.05),-dp/dt max (mmHg/s)絕對(duì)值升高(P0.05)。提示MSCs-Angl干預(yù)后對(duì)左室收縮功能顯著改善。4.血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè)與對(duì)照組比較,24h時(shí)LPS組cTnI水平開(kāi)始上升并有差異,48h時(shí)cTnI水平達(dá)到高峰,48h-8d持續(xù)升高,提示心肌損傷較重,但MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后較LPS組有顯著差異(P0.05),8d時(shí)cTnI水平較前減低,15d時(shí)明顯減低,心肌損傷明顯好轉(zhuǎn)。NT-proBNP水平,與對(duì)照組比較,24h時(shí)LPS組NT-proBNP水平開(kāi)始上升并有差異,48h時(shí)NT-proBNP水平達(dá)到高峰,48h-8d持續(xù)升高,提示心肌損傷較重的同時(shí),心臟功能明顯降低,但MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后較LPS組有顯著差異(P0.05),8d-15d雖然有降低趨勢(shì),但仍持續(xù)升高,提示雖然心肌損傷好轉(zhuǎn),但是心臟功能減低持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng),且心功能不易短期較快恢復(fù)。5.LPS誘導(dǎo)大鼠左室重塑心肌炎癥、細(xì)胞凋亡及MSCs-Angl移植的影響5.1 LPS誘導(dǎo)后大鼠心肌炎癥反應(yīng)及MSCs-Angl移植的影響HE染色：LPS組與正常對(duì)照組比較,可見(jiàn)灶性間質(zhì)水腫,心肌纖維斷裂、雜亂排序,間質(zhì)血管淤血,局部粒細(xì)胞增多；與LPS組比較,MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后的兩組,病理情況有所改善。MSCs-Angl移植影響LPS誘導(dǎo)大鼠心肌炎性因子TNF-α、IL-6的表達(dá)免疫組織化學(xué)檢測(cè)TNF-α、IL-6的表達(dá)：對(duì)照組,心肌細(xì)胞內(nèi)少量、稀疏淺棕顆粒;LPS組胞漿見(jiàn)較多深棕顆粒,MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后的兩組與LPS組相比,見(jiàn)棕色顆粒分布呈現(xiàn)散在且稀、疏,減少。Western-Blot檢測(cè)TNF-α、IL-6蛋白的表達(dá)：LPS組TNF-αΟIL-6表達(dá)明顯增高(P0.01)。經(jīng)MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后,與LPS組比較,可見(jiàn)心肌組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)呈不同程度的下降(P0.05)。5.2 LPS誘導(dǎo)大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡及MSCs-Ang1移植的影響電鏡觀察凋亡細(xì)胞：LPS組顯示線粒體排列紊亂,明顯增多、腫脹,部分線粒體溶解、嵴斷裂,部分肌絲斷裂；MSCs與MSCs-Ang1干預(yù)后,與LPS組相比,各種病變均有所減輕,MSCs-Ang1干預(yù)較MSCs更明顯改善。TUNEL染色觀察：較對(duì)照組,LPS組左室凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率顯著增加(P0.01)。MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后與LPS組相比,細(xì)胞凋亡率明顯減少(P0.01)。MSCs-Angl移植抑制心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)RIP3、Caspase-3表達(dá)(1)凋亡相關(guān)RIP3表達(dá)免疫組化染色：較對(duì)照組,LPS組RIP3棕黃色陽(yáng)性顆粒表達(dá)增加,且分布在細(xì)胞核周圍較多,MSCs與MSCs-Ang1兩組與LPS組比較,細(xì)胞內(nèi)棕黃色陽(yáng)性顆粒表達(dá)減少,且MSCs-Ang1注射后,棕黃色顆粒明顯減少。Western-Blot檢測(cè)RIP3蛋白表達(dá)：較對(duì)照組,LPS組表達(dá)顯著增高(P0.01)；但MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后,與LPS組比較,RIP3蛋白表達(dá)不同水平降低(P0.01-0.05)。(2)凋亡相關(guān)Caspase-3表達(dá)Western-Blot檢測(cè)Cleaved Caspase-3/Caspase-3蛋白比值表達(dá)：LPS組與對(duì)照組比較,比值顯著增高(P0.01)；但MSCs與MSCs-Angl干預(yù)后,與LPS組比較,比值不同水平降低(P0.01-0.05)。6. GFP mRNA表達(dá)外源性MSCs-Angl細(xì)胞在心肌組織植入情況檢測(cè)在移植后第48h、8d MSCs-Angl組的GPF mRNA表達(dá)顯著高于空載MSCs,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而在早期MSCs-Angl組的GPFmRNA表達(dá)也高于空載MSCs但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。移植后第24h、48h、8d,3組細(xì)胞RT-PCR檢測(cè)GPFmRNA表達(dá)增加(P0.05),均提示Angl能促進(jìn)MSCs在損傷后的心肌組織存活與植入。研究結(jié)論1.人臍帶中可分離培養(yǎng)大量穩(wěn)定增殖的MSCs,其細(xì)胞表型穩(wěn)定,存在向成骨、脂肪細(xì)胞等多向分化能力,利用病毒轉(zhuǎn)染技術(shù),首次將攜帶GFP報(bào)告基因和Ang1基因的慢病毒載體高效的轉(zhuǎn)染人臍帶MSCs。2.轉(zhuǎn)染于臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的Ang1基因可通過(guò)減少中性粒細(xì)胞肺部浸潤(rùn)及MPO活性減輕肺水腫等明顯改善LPS誘發(fā)的肺損傷、減輕LPS引起的全身炎癥反應(yīng)；提高了干細(xì)胞向炎性損傷肺組織的遷徙和植入。3.LPS可導(dǎo)致大鼠心肌重塑及左心功能障礙,UC-MSCs-Angl干預(yù)后,可抑制損傷心肌組織中炎癥因子及凋亡相關(guān)基因的表達(dá),不同程度降低血清中cTnI、含量,提示抑制損傷心肌組織的炎癥反應(yīng)與細(xì)胞凋亡,顯著降低LPS誘導(dǎo)大鼠的LVEDP和-dp/dt max,增加LVEF和+dp/dt max。提示改善左心室功能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R563.8

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 本刊編輯部;;我國(guó)首家間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)在天津落成[J];中國(guó)藥業(yè);2006年07期

2 張?chǎng)?趙桂秋;;間充質(zhì)干細(xì)胞在眼科領(lǐng)域的研究與應(yīng)用[J];中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù);2009年06期

3 史春夢(mèng);;間充質(zhì)干細(xì)胞表述中需要注意的幾個(gè)問(wèn)題[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2009年14期

4 瞿海龍;邊劍飛;張冰;王穎;周英蓮;;間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用的前景與困惑[J];醫(yī)學(xué)研究與教育;2011年05期

5 郭子寬;;間充質(zhì)干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用中的幾個(gè)問(wèn)題[J];中國(guó)組織工程研究;2012年01期

6 李炳堯;武曉云;吳巖;;間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng):從實(shí)驗(yàn)室到臨床[J];中國(guó)組織工程研究;2013年14期

7 吳實(shí);鄧列華;;皮膚間充質(zhì)干細(xì)胞在促進(jìn)皮膚愈合中的作用[J];實(shí)用皮膚病學(xué)雜志;2013年03期

8 吳清法,王立生,吳祖澤;間充質(zhì)干細(xì)胞的來(lái)源及臨床應(yīng)用[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2002年03期

9 黃定強(qiáng);間充質(zhì)干細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué)(耳鼻咽喉科學(xué)分冊(cè));2003年03期

10 付文玉,路艷蒙,喬?hào)|訪,樸英杰;運(yùn)用組織工程學(xué)原理構(gòu)建間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系[J];濰坊醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2003年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 陳可;王丁;韓之波;朱德林;韓忠朝;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外發(fā)揮免疫活性的研究[A];第12屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2009年

2 金明順;張毅;賈秀芬;周燕華;閆妍;劉慧雯;;小鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及多潛能分化的研究[A];中國(guó)解剖學(xué)會(huì)第十一屆全國(guó)組織學(xué)與胚胎學(xué)青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編[C];2009年

3 李爭(zhēng)艷;劉楊;翟麗麗;楊迷玲;王立峰;;間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤發(fā)展過(guò)程中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)病理學(xué)分會(huì)2009年學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

4 張彥;李尚珠;;間充質(zhì)干細(xì)胞在血管工程中的機(jī)制及應(yīng)用[A];2009全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合周圍血管疾病學(xué)術(shù)交流會(huì)論文集[C];2009年

5 石玉;戴\戎;;周期性拉應(yīng)力對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化影響的研究[A];第九屆全國(guó)生物力學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

6 黎嬌;朱爭(zhēng)艷;杜智;駱瑩;王鵬;高英堂;;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分泌物對(duì)肝細(xì)胞增殖和凋亡的影響[A];天津市生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)會(huì)第30次學(xué)術(shù)年會(huì)暨生物醫(yī)學(xué)工程前沿科學(xué)研討會(huì)論文集[C];2010年

7 譚遠(yuǎn)超;Kevin;姜紅江;黃相杰;周紀(jì)平;;間充質(zhì)干細(xì)胞在骨傷疾病治療中的應(yīng)用[A];首屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合骨科微創(chuàng)學(xué)術(shù)交流會(huì)暨專業(yè)委員會(huì)成立大會(huì)論文匯編[C];2011年

8 唐佩弦;;間充質(zhì)干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用前景[A];第三屆全國(guó)血液免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2003年

9 戴育成;;間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性和應(yīng)用[A];2005年華東六省一市血液病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨浙江省血液病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2005年

10 胡琳莉;王昕榮;錢坤;李舟;楊薇;朱桂金;;小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞向子宮內(nèi)膜分化的實(shí)驗(yàn)研究[A];第一屆中華醫(yī)學(xué)會(huì)生殖醫(yī)學(xué)分會(huì)、中國(guó)動(dòng)物學(xué)會(huì)生殖生物學(xué)分會(huì)聯(lián)合年會(huì)論文匯編[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 滿學(xué)杰;天津?yàn)I海新區(qū)建最大間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)基地[N];新華每日電訊;2008年

2 滿學(xué)杰;津昂賽打造間充質(zhì)干細(xì)胞生產(chǎn)基地[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2008年

3 第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院輸血科 李忠俊 整理 吳劉佳;間充質(zhì)干細(xì)胞研究又見(jiàn)新方法[N];健康報(bào);2013年

4 上海生科院 上海交大醫(yī)學(xué)院健康科學(xué)研究所 曹楷;間充質(zhì)干細(xì)胞：干細(xì)胞中的孫悟空[N];上�？萍紙�(bào);2014年

5 記者　陳建強(qiáng);首家間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)在津建成[N];光明日?qǐng)?bào);2006年

6 記者　馮國(guó)梧;細(xì)胞產(chǎn)品國(guó)家工程中心建設(shè)方案獲準(zhǔn)[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

7 實(shí)習(xí)生 劉霞;間充質(zhì)干細(xì)胞有望用于面部整形[N];科技日?qǐng)?bào);2007年

8 本報(bào)記者 王新佳;我國(guó)“原始間充質(zhì)干細(xì)胞”注射液進(jìn)入臨床研究[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2005年

9 馮國(guó)梧;全球首個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)規(guī)模化運(yùn)營(yíng)[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

10 劉瑩清;全球首個(gè)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞庫(kù)泰達(dá)規(guī)模運(yùn)營(yíng)[N];北方經(jīng)濟(jì)時(shí)報(bào);2008年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王皓;五指山小型豬OCT-4、SOX-2基因在骨髓間充質(zhì)與臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的過(guò)表達(dá)研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

2 孔德曉;間充質(zhì)干細(xì)胞及胰島素分泌細(xì)胞治療糖尿病的臨床及應(yīng)用基礎(chǔ)研究[D];山東大學(xué);2015年

3 董苑;SDF-1復(fù)合PDPBB的構(gòu)建及對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞趨化影響的研究[D];昆明醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王磊;誘導(dǎo)胎盤來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];山東大學(xué);2015年

5 房賀;連接黏附分子A在促進(jìn)MSC修復(fù)CC14肝損傷中的作用及其機(jī)制[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2015年

6 陳潔;間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體對(duì)急性肺損傷小鼠的影響及相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2015年

7 許婷;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1在蟑螂過(guò)敏原誘導(dǎo)的哮喘中對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞募集遷移的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

8 周雅麗;攜氧間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)胃癌化療效果的影響及其機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2015年

9 沈舒寧;CKIP-1負(fù)調(diào)控間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 姚惟琦;脂肪來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞治療急性腎損傷[D];武漢大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 李超;小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中AC基因亞型的表達(dá)及AC3對(duì)其纖毛長(zhǎng)度的影響[D];河北大學(xué);2015年

2 林濤;殼聚糖水凝膠復(fù)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 彭龍英;心肌營(yíng)養(yǎng)素1促進(jìn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化存活及PI3K/Akt信號(hào)通路機(jī)制研究[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2015年

4 喬曉慧;酸性環(huán)境對(duì)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

5 張紅霞;人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、鑒定及其對(duì)人肺癌細(xì)胞惡性表型的影響[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2015年

6 顧立超;BTK抑制劑對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞miR-21的調(diào)節(jié)作用[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

7 王文杰;鴨胚間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及其移植修復(fù)肝損傷研究[D];中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2015年

8 張猛;血管內(nèi)皮前體細(xì)胞對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞分化潛能的影響[D];石河子大學(xué);2015年

9 馬麗媛;利用MyoD基因誘導(dǎo)綿羊臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

10 宋維文;MicroRNA-133誘導(dǎo)綿羊間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成肌細(xì)胞的研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1633500