發(fā)布時(shí)間：2018-03-18 00:00

  本文選題：運(yùn)脾津　切入點(diǎn)：津力達(dá)　出處：《南京中醫(yī)藥大學(xué)》2015年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：2型糖尿病(Type 2 Diabetes mellitus, T2DM)是由多種病因引起的以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病,屬于中醫(yī)“消渴病”范疇。近代醫(yī)家張錫純提出消渴“消渴一證,古有上中下之分,謂其證皆起于中焦而極于上下”,揭示了消渴(T2DM)病位、病性與病勢(shì),有鑒于此,本文提出消渴發(fā)病與“脾”密切相關(guān),主要是由于脾失運(yùn)化導(dǎo)致的機(jī)體水液代謝與輸布、飲食精微轉(zhuǎn)輸與利用的紊亂及不平衡狀態(tài)所致�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為T(mén)2DM同時(shí)伴有因胰島素分泌或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白質(zhì)異常代謝,胰島細(xì)胞功能缺陷和胰島素抵抗是T2DM的兩大病理生理基礎(chǔ)。目的：本研究提出從“脾”論治消渴(T2DM)的學(xué)術(shù)觀(guān)點(diǎn),采用“運(yùn)脾津”治則指導(dǎo)下研制的藥物津力達(dá)顆粒作為藥物干預(yù),通過(guò)建立T2DM大鼠模型,觀(guān)察糖尿病胰島功能病變特征及津力達(dá)顆粒的干預(yù)作用及機(jī)制；高脂飲食誘導(dǎo)建立胰島素抵抗大鼠模型,觀(guān)察津力達(dá)顆粒對(duì)糖脂代謝及胰島素敏感性的干預(yù)作用及機(jī)制；建立軟脂酸誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷模型,觀(guān)察津力達(dá)顆粒對(duì)INS-1細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。通過(guò)上述整體動(dòng)物和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究,以期為消渴(T2DM)的治療提供有效方法與方藥,同時(shí)也為消渴病從“脾”論治提供實(shí)驗(yàn)支持。方法：本研究分為以下兩部分內(nèi)容：理論研究方法：本文系統(tǒng)梳理消渴病病名、病因、病機(jī)和治療的歷史源流,探析近代醫(yī)家張錫純提出的消渴“起于中焦而極于上下”理論及臨證應(yīng)用,從“脾”立論,提出“脾失健運(yùn)、水谷津液代謝異常”是消渴病主要病機(jī),“脾失健運(yùn)、痰瘀阻絡(luò)”是消渴病引發(fā)全身并發(fā)癥主要病機(jī),確立“運(yùn)脾津”治則并綜合治脾諸法：益脾氣、養(yǎng)脾陰、燥脾濕、泄脾熱、溫脾陽(yáng)、暢脾氣、通脾絡(luò),形成津力達(dá)顆粒組方,分析津力達(dá)顆粒組方特點(diǎn)及其臨床及實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展,以期為消渴病治療提供有效治法與方藥。實(shí)驗(yàn)研究方法：1.滓力達(dá)顆粒對(duì)T2DM大鼠胰島功能干預(yù)作用研究90只SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、吡格列酮組(4.5 mg/kg體重)和津力達(dá)低、中、高劑量組(0.75、1.5、3.0g/kg體重),每組15只,除正常組外,其余各組予高脂飼料喂養(yǎng)。喂養(yǎng)6周后,腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)(30mg/kg)誘導(dǎo)T2DM模型,72h后血糖儀測(cè)定空腹血糖≥13.9mmol/L為模型成功,不符合標(biāo)準(zhǔn)者剔除。造模成功后給藥6周,正常組和模型組給予等體積純水灌胃。造模后除正常組外,其余各組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。末次給藥后禁食12h,10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血分離血清,全自動(dòng)生化儀檢測(cè)空腹血糖(FBG)、放射免疫法檢測(cè)空腹胰島素(FINS)以計(jì)算胰島p細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-p);透射電鏡觀(guān)察各組大鼠胰島p細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；Westernblot方法檢測(cè)胰腺組織胱天蛋白酶3 (Casepase3)、自噬相關(guān)蛋白(p62、Atg7、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、Beclin-1)蛋白表達(dá)；免疫組織化學(xué)方法觀(guān)察胰島細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)。2.津力達(dá)顆粒對(duì)胰島素抵抗大鼠糖脂代謝及胰島素敏感性干預(yù)作用研究動(dòng)物分組同上,每組10只,除正常組外,其余各組予高脂飼料喂養(yǎng)6周,行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)判斷動(dòng)物是否造模成功,模型組空腹血糖13.9mmol/L、每個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖高于正常組且AUC面積與正常組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,評(píng)價(jià)為模型成功。造模成功后給藥6周,正常組和模型組給予等體積純水灌胃。造模后除正常組外,其余各組繼續(xù)予高脂飼料喂養(yǎng)。末次給藥后禁食12h,10%水合氯醛麻醉,腹主動(dòng)脈取血分離血清,檢測(cè)FBG、FINS,計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR);全自動(dòng)生化儀檢測(cè)總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、游離脂肪酸(FFA)；油紅O染色觀(guān)察各組大鼠肝臟細(xì)胞脂滴沉積情況；透射電鏡觀(guān)察各組大鼠肝臟細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化；ELISA法檢測(cè)血清大鼠血清抵抗素(Resistin)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNFa)水平；Western blot檢測(cè)肝臟細(xì)胞糖脂代謝相關(guān)通路(AMPK/ACC通路)中p-AMPK、AMPK、p-ACC、ACC蛋白表達(dá)、胰島素信號(hào)相關(guān)通路(PI3K/Akt通路)中p-PI3K、 PI3K、p-Akt、Akt、GLUT4蛋白表達(dá)。3.津力達(dá)顆粒對(duì)軟脂酸(PA)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷的干預(yù)作用研究體外培養(yǎng)INS-1細(xì)胞,以CCK-8方法檢測(cè)不同濃度(100,200,300,400 μg/mL) JLD對(duì)INS-1細(xì)胞生存活性的影響以判定滓力達(dá)對(duì)細(xì)胞是否具有毒性；給予最適濃度JLD 4 h后,加入PA共同處理細(xì)胞24 h, CCK-8方法檢測(cè)細(xì)胞活性,RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白(BAX、Bcl-2)、Atg7、Beclin-1基因表達(dá)；以CompoundC處理細(xì)胞,檢測(cè)其對(duì)PA損傷下INS-1細(xì)胞p62基因表達(dá)的影響。結(jié)果：1.津力達(dá)顆粒對(duì)2型糖尿病(T2DM)大鼠胰島功能干預(yù)作用研究結(jié)果：生化檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組血糖升高、胰島素水平降低,胰島p細(xì)胞功能指數(shù)降低(P0.01)用藥組空腹血糖降低、空腹血清胰島素水平及血清胰島p細(xì)胞功能指數(shù)水平升高,其中津力達(dá)中、高劑量組與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義p0.05,P0.01)；電鏡結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠胰島p細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷,各用藥組大鼠胰島p細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷改善,胰島p細(xì)胞病變減輕；Westernblot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組凋亡相關(guān)蛋白Casepase3表達(dá)增加,自噬相關(guān)蛋白p62、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)增加、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)降低(P0.05,P0.01)；與模型組比較,用藥組Casepase3表達(dá)降低,p62、LC3Ⅰ蛋白表達(dá)降低、Atg7、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)升高(P0.05)；免疫組化結(jié)果均顯示,與正常組比較,模型組中胰島p細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)減少,與模型組相比,JLD組Beclin-1莨達(dá)增加,Westemblot結(jié)果顯示變化趨勢(shì)與免疫組化結(jié)果相同,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。2.津力達(dá)顆粒對(duì)胰島素抵抗大鼠糖脂代謝及胰島素敏感性干預(yù)作用研究結(jié)果：生化檢測(cè)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠血清TC、TG、LDL-C、FFA水平顯著升高,HDL-C水平顯著下降(P0.01)。與模型組比較,津力達(dá)低劑量組對(duì)FFA的調(diào)整作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,津力達(dá)中、高劑量組對(duì)TC、TG、FFA的調(diào)整作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義儼0.05,P0.01)。胰島素抵抗指數(shù)檢測(cè)顯示,實(shí)驗(yàn)?zāi)┠Ｐ徒M大鼠HOMA-IR升高(P0.01),與模型組比較各用藥組HOMA-IR降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,P0.01)；油紅O染色與電鏡結(jié)果顯示,模型組大鼠肝臟細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂滴、肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷,各用藥組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴減少,大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷改善。ELISA結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠血清Resistin、 IL6、TNFα水平升高(P0.01),與模型組比較,津力達(dá)中高劑量組Resistin、TNFα水平降低,津力達(dá)高劑量組IL6水平降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05,0.01)。Western blot結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組大鼠肝臟p-ACC、p-AMPK蛋白表達(dá)降低(P0.01)；與模型組比較,用藥組肝胸p-ACC、p-AMPK表達(dá)增加(P0.01)；與正常組比較,模型組大鼠肝臟p-PI3K、 p-Akt、GLUT4表達(dá)降低,用藥組大鼠肝臟p-PI3K、p-Akt、GLUT4表達(dá)增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。3.津力達(dá)顆粒對(duì)軟脂酸(PA)誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷的干預(yù)作用研究結(jié)果：CCK-8結(jié)果顯示,津力達(dá)各用藥劑量組細(xì)胞較正常組細(xì)胞生存活性無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；PA損傷后INS-1細(xì)胞生存活性降低,BAX、Atg7、Beclin-1基因表達(dá)增加,Bcl-2基因表達(dá)降低(P0.01),用藥后,細(xì)胞生存活性增加(P0.01),細(xì)胞BAX基因表達(dá)減少,Bcl-2、Atg7、 Beclin-1基因表達(dá)增加；CompoundC能阻斷PA環(huán)境下津力達(dá)對(duì)p62基因表達(dá)的調(diào)節(jié)作用(P0.01)。結(jié)論：1.理論研究：本研究基于近代名醫(yī)張錫純《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》提出的“消渴一證,古有上中下之分,謂其證皆起于中焦而極于上下”學(xué)術(shù)思想,在系統(tǒng)整理研究歷代醫(yī)家關(guān)于消渴病病名、病因、病機(jī)及治療研究基礎(chǔ)上,提出從“脾”論治消渴學(xué)術(shù)觀(guān)點(diǎn),指出機(jī)體水液代謝與輸布、飲食精微轉(zhuǎn)輸與利用的紊亂及不平衡狀態(tài)為其發(fā)病之關(guān)鍵,提出“脾失健運(yùn)、水谷津液代謝異常”是消渴病主要病機(jī), “脾失健運(yùn)、痰瘀阻絡(luò)”是消渴病引發(fā)全身并發(fā)癥主要病機(jī),確立“運(yùn)脾津”治則并綜合治脾諸法：益脾氣、養(yǎng)脾陰、燥脾濕、泄脾熱、溫脾陽(yáng)、暢脾氣、通脾絡(luò),并據(jù)此形成津力達(dá)顆粒組方,為消渴病(T2DM)臨床防治研究開(kāi)辟了有效途徑和藥物。2.實(shí)驗(yàn)研究：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明,津力達(dá)顆粒有效調(diào)節(jié)T2DM大鼠血糖及胰島素分泌,保護(hù)p細(xì)胞結(jié)構(gòu),維持胰島功能,減少胰島細(xì)胞凋亡,保護(hù)胰島細(xì)胞數(shù)量。同時(shí)調(diào)整胰島素抵抗大鼠糖脂代謝,調(diào)節(jié)血清脂肪因子及炎癥因子,減輕肝臟脂質(zhì)沉積,改善胰島素敏感性,其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AMPK/ACC及PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),津力達(dá)顆粒改善軟脂酸誘導(dǎo)的INS-1細(xì)胞損傷,增加其生存活性,激活其自噬,機(jī)制可能與激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)相關(guān)通路有關(guān)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)研究佐證了消渴從“脾”論治的科學(xué)價(jià)值,驗(yàn)證了津力達(dá)在改善胰島素抵抗、治療T2DM方面的確切作用,為臨床治療提供了有效治療藥物。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R259

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