發(fā)布時(shí)間：2018-03-15 21:54

  本文選題：神經(jīng)干細(xì)胞　切入點(diǎn)：C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞　出處：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：探討神經(jīng)干細(xì)胞與替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠生存狀況的影響。方法：實(shí)驗(yàn)共分三部分。第一部分：大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定。(1)選用孕12-14天的胎鼠，從這些胎鼠腦中分離出神經(jīng)干細(xì)胞(Neuralstem cells，NSCs)，然后利用無血清培養(yǎng)的方式進(jìn)行培養(yǎng)以及傳代；(2)對(duì)分離出的神經(jīng)干細(xì)胞用免疫熒光進(jìn)行Nestin鑒定，，然后將純化后的第3-4代神經(jīng)干細(xì)胞球重懸，并進(jìn)行培養(yǎng)，使得其活性呈最佳狀態(tài)，并調(diào)整細(xì)胞密度為4x106個(gè)/20ul待用。第二部分：大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型建立。(1)取凍存的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)，測(cè)定細(xì)胞存活率，取其對(duì)數(shù)期細(xì)胞，同時(shí)調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/20ul待用，并將部分未用的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞凍存；(2)取對(duì)數(shù)期的C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞，利用腦立體定向儀向大鼠的尾狀核接種，構(gòu)建C6腦膠質(zhì)瘤模型大鼠90只，觀察大鼠術(shù)后的生存質(zhì)量以及生存時(shí)間，并記錄，其中有8只大鼠意外死亡。第三部分:神經(jīng)干細(xì)胞與替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠生存狀況影響。利用神經(jīng)干細(xì)胞與替莫唑胺治療大鼠C6膠質(zhì)瘤，經(jīng)第二部分處理后的第7天，將剩下的82只模型大鼠隨機(jī)抽取兩只處死，剖顱取出腫瘤組織進(jìn)行HE染色。剩下80只隨機(jī)分為四組：對(duì)照組（A組）、神經(jīng)干細(xì)胞植入組（B組）、替莫唑胺組（C組）、替莫唑胺聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞組（D組）；A組：麻醉并固定，立體定位頭架引導(dǎo)下向瘤內(nèi)注入生理鹽水20ul。 B組：麻醉固定，在立體定位頭架的引導(dǎo)下將總數(shù)為4x106個(gè)的20ul神經(jīng)干細(xì)胞注入其瘤內(nèi)。C組：利用灌胃針向大鼠灌入替莫唑胺：50mg／kg，連服5天。D組：麻醉固定，在立體定位頭架的引導(dǎo)下將總數(shù)為4x106個(gè)的20ul神經(jīng)干細(xì)胞注入其瘤內(nèi)，神經(jīng)干細(xì)胞注入的第二天開始用灌胃針向大鼠灌入替莫唑胺50mg／kg，連服5天。對(duì)大鼠生存質(zhì)量及生存期進(jìn)行觀測(cè)、記錄，對(duì)大鼠的生存期行生存分析，并繪制圖表；模型大鼠死亡后行剖顱探查并取出腫瘤，觀察并用電子天平稱量，記錄數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并繪制圖表；稱量后將腫瘤組織進(jìn)行HE染色。 結(jié)果：第一部分大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定：分離的胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞，大量的細(xì)胞呈單細(xì)胞懸浮生長(zhǎng)的狀態(tài)，并形成大小不等、細(xì)胞量不同的細(xì)胞球；行免疫熒光染色Nestin呈陽性，證實(shí)了該細(xì)胞為有活性的神經(jīng)干細(xì)胞。第二部分大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型建立：(1)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在對(duì)數(shù)期時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)排列緊密，疏密均勻，貼壁較牢；大多數(shù)呈多角形、梭形。(2)構(gòu)建90只SD雄性大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型：術(shù)中2只大鼠死于麻醉意外，4只大鼠于手術(shù)第三天死于顱內(nèi)血腫，2只大鼠于第5天不明原因死亡；剩余的82只模型大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)處理與分析。建模大鼠手術(shù)后第2天即自行覓食，但活動(dòng)量、進(jìn)食及飲水量較術(shù)前減少，皮毛不整潔，顏色欠光澤，精神萎靡；接種后第6天，攻擊行為、逃避行為均有增強(qiáng)。第三部分神經(jīng)干細(xì)胞與替莫唑胺對(duì)腦膠質(zhì)瘤大鼠生存狀況影響：神經(jīng)干細(xì)胞植入組（B組）、替莫唑胺組（C組）及替莫唑胺聯(lián)合神經(jīng)干細(xì)胞組（D組）較對(duì)照組（A組）生存質(zhì)量明顯的改善；A、B、C、D四組的平均生存期分別為：23.700天、28.600天、28.900天、29.500天。采用兩兩間的Kaplan-Meier法分析：B、C、D三組均較A組生存期延長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異(p0.05)，但B、C、D三組之間生存期比較卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。各組大鼠死亡后剖顱觀察：均可在右側(cè)大腦半球稍前端形成橢圓形腫瘤。A、B、C、D四組腫瘤重量分別為：104.105±9.877mg，95.175±9.387mg，95.870±9.542mg，95.905±8.807mg；行組間的方差分析，F(xiàn)=4.061，P=0.010，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以認(rèn)為四組的重量不全相同；故采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，經(jīng)t檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較提示：A組大鼠的腫瘤重量較B、C、D三組均較重，比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)； B、C、D組之間兩兩比較示：腫瘤重量的比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。四組的膠質(zhì)瘤組織HE染色切片都見腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)極為活躍，并伴有一定的浸潤(rùn)性；正常腦組織與腫瘤交界處能見到大量浸潤(rùn)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，有明顯的界線，瘤體內(nèi)的血管增多增粗。 結(jié)論：(1)神經(jīng)干細(xì)胞能用Nestin法鑒定，鑒定后可用于有關(guān)神經(jīng)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。 (2)采用立體定向法建立大鼠C6腦膠質(zhì)瘤模型可靠性、穩(wěn)定性較高，該模型是腦膠質(zhì)瘤較為理想動(dòng)物模型，適于腦膠質(zhì)瘤的實(shí)驗(yàn)研究。 (3)神經(jīng)干細(xì)胞可延長(zhǎng)腦膠質(zhì)瘤大鼠的生存期，提高生存質(zhì)量，減輕腫瘤重量。 (4)神經(jīng)干細(xì)胞聯(lián)合替莫唑胺較單一的替莫唑胺或神經(jīng)干細(xì)胞治療膠質(zhì)瘤大鼠，生存期、生存質(zhì)量以及腫瘤重量未見明顯改善。
[Abstract]:Objective: To investigate the effects of neural stem cells and temozolomide on rat brain glioma survival. Methods: the experiment is divided into three parts. The first part: the neural stem cells isolated from rat, cultured and identified. (1) the pregnant 12-14 day fetal rats, neural stem cells can be isolated from the fetal in rats (Neuralstem cells, NSCs), and then use the serum-free culture way were cultured and passaged; (2) on the isolated neural stem cells were identified by Nestin immunofluorescence, and then purified the 3-4 generation of neural stem cells resuspended and were cultured, the activity was the best state, and adjust the cell density of 4x106 /20ul for use. The second part is the establishment of rat C6 glioma model. (1) the cell recovery, the cryopreservation of C6 glioma cell culture, cell viability was determined from the logarithmic phase cells, and the cell density was adjusted to 106 /20ul to be 鐢

本文編號(hào)：1616978