本文選題：缺血缺氧性腦損傷　切入點：分子伴侶　出處：《吉林大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：缺血缺氧性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE)是由多種原因引起的腦組織缺血缺氧所導致的腦部病變。該病在任何年齡階段均可發(fā)生,由于缺血缺氧性腦病能夠引起神經(jīng)元的死亡和神經(jīng)功能缺失,導致不良預后,因此是神經(jīng)系統(tǒng)疾病防治的重點之一。以往的研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧所導致的腦損傷程度因神經(jīng)元成熟度的不同而有所區(qū)別,未發(fā)育成熟的大腦比成熟的大腦對缺血缺氧損傷的抵抗能力更強,然而其潛在的機制仍不明確的。所以,探討不同發(fā)育程度的大腦在缺血缺氧損傷后應激反應的區(qū)別對提高缺血缺氧性腦病的治療效果具有積極的意義。在本研究中,我們從缺血缺氧腦損傷后的熱休克反應入手,主要進行了兩部分實驗,在實驗的第一部分,我們探討了缺血缺氧性腦損傷后分子伴侶在不同發(fā)育階段腦組織中的差異性表達,以及未成熟和成熟腦在缺血缺氧損傷后HSF1在不同亞細胞機構中的差異性表達;在實驗的第二部分,我們探討了在非應激狀態(tài)下,分子伴侶在不同發(fā)育階段大腦中的原始表達水平。通過該項研究,進一步揭示了缺血缺氧性腦損傷的發(fā)病機制,為成人和新生兒在缺血缺氧損傷后治療的不同靶點提供研究基礎和理論依據(jù)。第一部分缺血缺氧性腦損傷后分子伴侶和HSF1發(fā)育依賴性表達的研究目的:探討缺血缺氧損傷后不同發(fā)育程度大腦中分子伴侶和HSF1的差異性表達。方法:(1)分別選取P7(出生后7天)和P26(出生后26天)Sprague-Dawley大鼠,采用Rice-Vannucci法建立缺血缺氧腦損傷的動物模型。于麻醉下結(jié)扎左側(cè)頸總動脈,術后恢復1小時,將實驗動物置于37℃恒溫水浴缺氧艙中,輸入氧濃度為8%的氮氧混合氣體,P7組動物缺氧時間為1h,P26組動物缺氧時間為30min,以保證兩組實驗動物缺氧損傷程度的一致性。然后將實驗動物置于常溫空氣狀態(tài)恢復。分別選擇缺血缺氧后30min,4h和24h留取樣本進行實驗分析。(2)對P7組和P26組不同恢復時間的腦組織采用原位雜交技術分別檢測HSP70、HSP60、GRP78的m RNA表達。(3)分別提取P7組和P26組不同恢復時間點的腦組織蛋白質(zhì),采用免疫印跡法對HSP70、HSP60、GRP78的蛋白質(zhì)表達進行檢測分析。(4)分別分離P7組和P26組不同恢復時間點的腦組織亞細胞結(jié)構,采用免疫印跡法對HSF1蛋白質(zhì)的差異性表達和核轉(zhuǎn)位進行檢測分析。(5)采用共聚焦顯微鏡觀察P7組和P26組HI后不同恢復時間的腦組織HSP70和HSF1的免疫組織化學熒光表達。結(jié)果:(1)在缺血缺氧性腦損傷后,P26缺血缺氧組和P7缺血缺氧組HSP70 m RNA的表達增高主要發(fā)生在損傷大腦半球同側(cè)的整個皮層,紋狀體、海馬和部分皮層下區(qū)域;在P26缺血缺氧組,HSP70 m RNA在HI后的30min表達開始增高,4h時達到高峰,24h時HSP70m RNA水平仍較對照組升高,但較缺血缺氧性腦損傷后4h有所下降。缺血缺氧性腦損傷后P7缺血缺氧組HSP70 m RNA的表達模式與P26缺血缺氧組相似,但與P26缺血缺氧組相比,缺血缺氧性腦損傷后HSP70 m RNA在P26大腦樣本中增高顯著,P7缺血缺氧組與P26缺血缺氧組組間比較差異有顯著性。在缺血缺氧腦損傷后,P26缺血缺氧組HSP60m RNA表達水平在缺血缺氧損傷后30min開始升高,4h和24h均持續(xù)增加。但在P7缺血缺氧組,HSP60m RNA的表達與對照組相比變化不明顯;在缺血缺氧腦損傷后,GRP78在P26缺血缺氧組和P7缺血缺氧組中的變化與HSP60m RNA大致相同,均沒有HSP70m RNA的表達增加顯著。(2)在缺血缺氧腦損傷后,P26缺血缺氧組大腦樣本中HSP70蛋白的在損傷后4h和24h表達明顯增加,但P7缺血缺氧組中只在損傷后24h有極微弱的增加。HSP60蛋白和GRP78的蛋白表達在缺血缺氧腦損傷后沒有明顯變化。(3)在缺血缺氧腦損傷后,P26缺血缺氧組HSF1蛋白表達并進行了重新分配,在缺血缺氧損傷后的30min、4h和24h,HSF1從細胞漿結(jié)構(S3)向細胞核結(jié)構(P1)發(fā)生了轉(zhuǎn)移。這種HSF1核轉(zhuǎn)位的現(xiàn)象在P26缺血缺氧組更為顯著。而在P7缺血缺氧組,HSF1的核轉(zhuǎn)位現(xiàn)象并不明顯,雖然在缺血缺氧損傷后的30min,細胞漿結(jié)構(S3)中的HSF1蛋白表達有所減少,但HSF1蛋白表在細胞核結(jié)構(P1)中卻沒有明顯的增加。(4)在缺血缺氧腦損傷后的30min,P26缺血缺氧組HSF1蛋白免疫熒光表達在皮層、海馬CA1和齒狀核區(qū)域的細胞核內(nèi)緩慢增加,在缺血缺氧損傷后的4h到24h表達穩(wěn)定上升。與之相對應,在缺血缺氧腦損傷后,在P26缺血缺氧組HSP70蛋白免疫熒光表達在HI后的4h也發(fā)生了上調(diào),但與HSF1相比,在皮質(zhì)、海馬CA1和齒狀核區(qū)域細胞質(zhì)內(nèi)的表達增加相對延遲些。P7缺血缺氧組樣本中HSF1蛋白免疫熒光表達水平和模式的變化并未發(fā)生在皮層、海馬CA1和齒狀核區(qū)域,即在損傷后的30min、4h和24h HSF1均未見明顯變化。另外,通過進一步的研究發(fā)現(xiàn),P7缺血缺氧組在缺血缺氧腦損傷后HSP70蛋白免疫熒光表達的微弱增加主要發(fā)生在小膠質(zhì)細胞中。結(jié)論:(1)與未發(fā)育成熟的腦組織相比,在缺血缺氧腦損傷后,發(fā)育成熟的腦組織中細胞的熱休克反應更加強烈,提示缺血缺氧腦損傷后發(fā)生的熱休克反應呈發(fā)育依賴性。(2)與未成熟腦組織相比,在缺血缺氧腦損傷后4h,發(fā)育成熟的腦組織分子伴侶m RNA表達水平顯著增加,尤其是在細胞漿中表達的HSP70更為明顯。(3)與未成熟腦組織相比,在缺血缺氧腦損傷后24h,成熟腦組織HSP70蛋白質(zhì)的表達水平顯著增高,與HSP70 m RNA的上調(diào)反應時間相比較,HSP70蛋白表達上調(diào)是延遲的。提示這種蛋白質(zhì)表達的延遲可能是成熟腦較未成熟腦對缺血缺氧損傷耐受差的原因之一。(4)與未成熟腦組織相比,在缺血缺氧腦損傷后,HSF1僅在成熟腦組織中發(fā)生了核轉(zhuǎn)位,HSF1向細胞核轉(zhuǎn)移,從而促進熱休克蛋白的合成。第二部分不同發(fā)育程度大腦分子伴侶原始水平差異性的研究目的:探討在非應激的正常狀態(tài)下,不同發(fā)育程度的大腦分子伴侶原始水平的表達差異。方法:分別選取P7(出生后7天)和P26(出生后26天)Sprague-Dawley大鼠。液氮冷凍后勻漿提取腦組織蛋白,采用免疫印跡法對P7組和P26組腦組織中熱休克因子HSF1和分子伴侶HSC70、HSP40、GRP78、GPR94、PDI和HSP60的原始水平進行檢測分析。結(jié)果:(1)P26組腦組織樣本中熱休克因子HSF1的水平明顯高于P7組。(2)在P7組和P26組腦組織樣本中,位于細胞漿中的分子伴侶HSC70和HSP40的水平幾乎相同。(3)位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的分子伴侶和折疊酶GRP78、GRP94和PDI的水平在P26組腦組織樣本中要低于P7組。(4)位于線粒體基質(zhì)的熱休克蛋白HSP60的水平在P26組腦組織樣本中要明顯高于P7組。結(jié)論:(1)與未成熟腦組織相比,HSF1在成熟腦組織中的原始水平顯著增高。(2)分子伴侶HSC70和HSP40的水平在成熟腦組織和未成熟腦組織中的原始水平幾乎相同。(3)與未成熟腦組織相比,成熟腦組織中HSP60的原始水平顯著增高。(4)與未成熟腦組織相比,成熟腦組織中GRP78、GRP94和PDI的原始水平明顯降低。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743

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