本文選題：膠質(zhì)瘤　切入點：GATA2　出處：《蘇州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分轉(zhuǎn)錄因子GATA2在EGFR/ERK/Elk-1信號通路中的調(diào)控作用背景與目的表皮細胞生長因子受體EGFR可以激活下游的信號分子ERK和Elk-1從而促進細胞生存并維持細胞的正常功能。EGFR過度表達后干擾細胞分化的正常調(diào)控,與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等惡性進展密切相關(guān)。轉(zhuǎn)錄因子GATA2是鋅指結(jié)構(gòu)GATA家族的重要成員,GATA2含有兩個鋅指,并以此結(jié)構(gòu)與靶基因相結(jié)合,從而激活或抑制EGFR通路中靶基因Elk-1的表達。GATA2在血癌、乳腺癌、前列腺癌中高表達已有報告,但膠質(zhì)瘤中的研究未見報道。本文第一部分旨在研究GATA2在膠質(zhì)瘤中的表達及調(diào)控機制。方法1、培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞系SW1783和U87,通過轉(zhuǎn)染GATA2表達質(zhì)粒及小分子干擾RNA技術(shù)(si RNA)分別增強和降低GATA2的表達。2、通過免疫印跡技術(shù)(Western Blot)分析GATA2、EGFR、Elk-1在膠質(zhì)瘤細胞系中的表達。3、以MTT法檢測轉(zhuǎn)染GATA2增強表達及siRNA干擾降低表達后對膠質(zhì)瘤細胞的增殖影響。4、通過微孔濾膜培養(yǎng)小室及雙室聯(lián)合培養(yǎng)系統(tǒng)(Transwell試驗)檢測轉(zhuǎn)染GATA2及si RNA干擾后對膠質(zhì)瘤細胞遷移及侵襲特征的影響。5、采用Elk-1熒光報告基因檢測Elk-1的活性與GATA2的表達水平的相關(guān)性。6、將56名多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme;GBM)患者組織標(biāo)本及6名非腫瘤患者腦組織對照標(biāo)本進行GATA2免疫組織化學(xué)染色。結(jié)果1、MTT法檢測發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染GATA2過表達后促進了SW1783細胞的增殖,通過siRNA降低U87細胞GATA2的表達后明顯抑制了U87細胞的增殖。2、Transwell試驗發(fā)現(xiàn)SW1783細胞轉(zhuǎn)染GATA2過表達后遷移和侵襲能力增強,U87細胞經(jīng)siRNA干擾后GATA2低表達時其遷移和侵襲能力降低。3、在U87細胞中應(yīng)用EGFR抑制劑AG1478以及ERK抑制劑U0126,免疫印跡技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)GATA2及磷酸化EGFR的表達水平也明顯下降;sw1783細胞經(jīng)100ng/mlegf處理后磷酸化egfr及gata2的表達明顯上升,說明gata2受egfr/erk信號通路調(diào)控。4、sw1783細胞中g(shù)ata2過表達后可以上調(diào)elk-1(egfr/erk信號通路的下游基因)的表達,u87細胞中sirna干擾后gata2表達下降后同時也下調(diào)了elk-1的表達。5、sw1783細胞中elk-1熒光報告基因檢測提示elk-1的活性高低與gata2的表達程度呈正相關(guān)。6、在膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本中g(shù)ata2陽性表達率73.2%(41/56)明顯高于對照正常腦組織16.7%(1/6),并且其表達的強度與患者的生存期呈負相關(guān)。結(jié)論在膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤臨床組織標(biāo)本中首次報告了gata2在egfr/erk/elk-1信號通路中的作用是調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的惡性表型,下調(diào)gata2的表達后可明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖、遷移和侵襲性,為進一步研究用基因敲低的方法治療膠質(zhì)瘤找到了新的靶分子。第二部分轉(zhuǎn)錄因子foxm1在wnt/β-catenin信號通路中的調(diào)控作用背景與目的研究發(fā)現(xiàn)foxm1是wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路新的下游靶基因,而且foxm1/β-catenin的相互作用可以激活經(jīng)典wnt信號途徑和維持神經(jīng)干細胞的自我更新,在高級別的膠質(zhì)母細胞瘤(gbm)中,foxm1的表達明顯高于低級別星形細胞瘤。針對wnt的治療雖然已有iwp2和lgk974等,但抗癌效果有限,而wnt-c59(c59)作為新型高效的wnt信號調(diào)節(jié)劑,通過選擇性抑制mboat家族成員porcupine介導(dǎo)的wnt蛋白棕櫚�；饔�,從而阻斷wnt分泌和功能發(fā)揮,在乳腺癌研究中收到了高效低毒的良好效果,目前尚無c59在腦腫瘤研究中的報道,本文第二部分旨在探討c59抑制foxm1/β-catenin后對wnt信號通路及膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)特征的影響。方法1、培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細胞系u87、人腦膠質(zhì)瘤干細胞系gsc11,通過外源性wnt3a和抑制劑c59分別處理膠質(zhì)瘤細胞,增強和降低foxm1的表達。2、通過免疫印跡技術(shù)(westernblot)分析wnt信號通路β-catenin、foxm1、axin-2、cyclind1在膠質(zhì)瘤細胞系中的表達。3、雙熒光素酶報告基因(top-flash)系統(tǒng)分析c59對膠質(zhì)瘤細胞中wnt活性的影響。4、實時定量pcr(realtimepcr)檢測wnt通路及foxm1受抑制后對相關(guān)下游基因cyclind1及c-myc等的影響。5、細胞免疫熒光染色技術(shù)分析c59對β-catenin的定位和入核的影響。6、通過干細胞成球?qū)嶒?neurosphereformationassay)研究c59對膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新、成球能力等干性特征的抑制作用。7、通過細胞劃痕試驗(woundscratchassay)和transwell實驗檢測c59對膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲能力的影響。8、cck-8法繪制細胞生長曲線,觀察c59及替莫唑胺(tmz)對膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用。結(jié)果1、免疫印跡技術(shù)證實wnt3a及c59分別可以上調(diào)和下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞u87、gsc11中foxm1和β-catenin基因的表達。2、通過westernblot證明c59明顯下調(diào)u87、gsc11細胞中wnt信號通路及下游基因axin-2、cyclind1的表達。3、雙熒光素酶報告基因(top-flash)系統(tǒng)分析顯示c59對膠質(zhì)瘤細胞中wnt活性抑制明顯。4、realtimepcr檢測證明c59導(dǎo)致wnt相關(guān)下游基因cyclind1及c-myc的mrna水平下降。5、免疫熒光染色技術(shù)證明c59阻止β-catenin入核,引起細胞核中的β-catenin水平下降。6、wnt抑制劑對膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新、成球能力等干性特征有明顯的抑制作用。7、細胞劃痕和transwell試驗證實c59降低了膠質(zhì)瘤細胞u87的遷移、侵襲能力。8、c59可顯著增強tmz對膠質(zhì)瘤細胞的增殖抑制作用,聯(lián)合c59后tmz從25μmol/l濃度開始即可明顯抑制腫瘤細胞的生長。結(jié)論首次在膠質(zhì)瘤細胞系和膠質(zhì)瘤干細胞中用阻斷分子信息通路的方法證明wnt通路抑制劑c59可以顯著抑制foxm1及β-catenin等基因的表達,從而引起了靶細胞的增殖、遷移、侵襲、自我更新、成球能力等下降,抑制wnt信號通路可以增加膠質(zhì)瘤細胞對tmz藥物的敏感性,對進一步研究用藥物阻斷調(diào)控膠質(zhì)瘤惡性表型的靶分子表達有重要意義。第三部分wnt/β-catenin/foxm1信號通路阻滯劑c59聯(lián)合替莫唑胺治療膠質(zhì)瘤的體內(nèi)研究背景與目的一方面,調(diào)控膠質(zhì)瘤惡性進展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不止一條,單一靶分子治療存在局限性;另一方面,tmz雖然已是膠質(zhì)瘤治療臨床一線藥物,但延長生存期的時間很有限。因此本部分在第二部分體外實驗基礎(chǔ)上,擬進行wnt信號阻滯劑c59聯(lián)合tmz治療膠質(zhì)瘤的動物體內(nèi)實驗,旨在探討膠質(zhì)瘤靶向信號通路治療與傳統(tǒng)化療聯(lián)合方案的可行性。方法1、動物模型制作:顱內(nèi)移植瘤模型,選擇5~6周齡純種balb/c雄性裸小鼠,以水合氯醛行腹腔注射麻醉后,小鼠頭頂部切開0.5cm長皮膚,顯露顱骨,用25μl微量注射器吸取10μl細胞懸液(含u87或gsc11細胞5×105),在立體定向儀輔助下緩慢(5min)注入鼠右側(cè)尾狀核內(nèi),骨蠟封閉骨孔,絲線縫合皮膚。2、動物模型分組及給藥途徑:顱內(nèi)移植瘤建模成功后將顱內(nèi)移植瘤實驗動物按接種細胞種類分為2大組(U87及GSC11),U87組內(nèi)及GSC11組內(nèi)再按照治療藥物分4組,對照組(不給藥)、C59治療組、TMZ治療組、C59聯(lián)合TMZ治療組,第二天開始按組別接受治療,分別為無藥、C59灌胃給藥10mg/kg/d共14天、TMZ灌胃給藥50mg/kg/d共14天、C59及TMZ灌胃聯(lián)合用藥14天。3、移植瘤體積及腫瘤免疫組化檢測:顱內(nèi)接種細胞后按組別給予不同的藥物治療,第28天處死各組實驗動物(每組n=5),取出腦組織,行HE染色觀察動物模型的致瘤率并測量腫瘤大小,免疫組化染色檢測FoxM1及β-catenin基因在移植瘤中的表達情況。4、荷瘤鼠生存期檢測:顱內(nèi)接種細胞后按組別給予不同的藥物治療(每組n=10),觀察記錄動物生存期,計算中位生存期(Median),進行生存曲線估計(Kaplan-Meier法)。結(jié)果1、顱內(nèi)移植瘤建模成功后,在早期實驗鼠生存狀態(tài)均良好,28天后發(fā)現(xiàn)2只實驗鼠出現(xiàn)惡病質(zhì)體征。2、各組藥物抑制移植瘤的增殖。顱內(nèi)接種后的第28天,處死實驗動物行HE染色腦組織發(fā)現(xiàn)動物模型的致瘤率為100%。HE染色后測量腫瘤最短徑(a)和最長徑(b),根據(jù)公式計算腫瘤體積V=a2×b/2,結(jié)果顯示在U87組內(nèi)和GSC11組內(nèi)提示C59、TMZ均能抑制裸鼠體內(nèi)移植瘤的生長,特別是兩者聯(lián)合治療組的治療效果最顯著。3、荷瘤鼠的生存期:U87組內(nèi)對照組、C59治療組、TMZ治療組、C59聯(lián)合TMZ治療組的中位生存期分別為38、54、66、94天,GSC11組內(nèi)的結(jié)果為32、48、52、85天,提示C59、TMZ均能延長荷瘤鼠的生存期,尤其是聯(lián)合治療組效果最好。4、免疫組化染色觀察FoxM1及β-catenin基因的表達,C59單獨及聯(lián)合TMZ治療后均可明顯下調(diào)它們在移植瘤中的表達水平。結(jié)論C59聯(lián)合TMZ治療顱內(nèi)荷人腦膠質(zhì)瘤裸小鼠模型的療效,從腫瘤體積和荷瘤鼠生存期等方面,比單一C59和單一TMZ的療效都要好,這對進一步探索膠質(zhì)瘤靶分子治療與傳統(tǒng)化療藥物聯(lián)合方案的可行性有重要價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

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本文編號：1587850