本文選題：富馬酸二甲酯　切入點：缺氧　出處：《山東大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景：研究已經(jīng)表明,骨折和骨骼的失載荷(失重力)能誘導骨細胞缺氧�，F(xiàn)已證明,其中,低氧誘導因子-1a (HIF-1a)是一種組織細胞低氧環(huán)境的分泌表達的重要分子,可以誘導多種炎性介質的表達,是機體在低氧狀態(tài)下調劑機體功能的一種重要氧依賴轉錄激活因子,介導骨折及骨骼失載荷中多種炎性因子的釋放,對于骨折愈合及骨質疏松是一種不利因素。其可以促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF).葡萄糖受體及促紅細胞生成素(EPO)生成,激活炎癥因子的表達,誘導泡沫細胞的形成,調控細胞的凋亡及分化�，F(xiàn)已證明,缺氧可以上調幾個重要基因的表達,包括可以促進新血管的形成和介導炎癥反應的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細胞介素-8(IL-8)。椎間盤退變亦能出現(xiàn)HIF-1α的高表達。富馬酸二甲酯(DMF)是最近批準的用于多發(fā)性硬化癥的一線治療藥物,它有良好的特征性的保護神經(jīng)、保護細胞作用。DMF可以調節(jié)不同類型的細胞中的免疫系統(tǒng)；是一種口服片劑,人們認為它是通過降低NF-κB依賴的基因的表達起作用的。缺氧時都會發(fā)生促炎癥反應和氧化應激,但是,有關DMF在缺氧時的生理作用,尤其是對HIF-1α的表達和功能的調節(jié)方面的信息在過往研究中卻鮮有報道。本研究中,我們期待證明DMF是一種新型的HIF-1α表達功能抑制劑。進而對于骨折、骨質疏松、椎間盤退變的治療提出-種新的思路。我們實驗分成兩部分來進行：一、富馬酸二甲酯抑制成骨細胞缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的表達及其功能。富馬酸二甲酯對椎間盤髓核中低氧誘導因子-la分泌及表達的影響。第一部分富馬酸二甲酯抑制成骨細胞缺氧誘導因子-1α (HIF-1α)的表達及其功能目的：探討富馬酸二甲酯(DMF)在調節(jié)成骨細胞HIF-lα表達和功能中所起的功能和作用。方法：在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素和鏈霉素(P/S)的α-基礎培養(yǎng)基(α-MEM)中培養(yǎng)小鼠成骨細胞MC3T3-E1(克降14)。缺氧處理前分別在蛋白酶體抑制劑MG132或N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸(N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, ALLN)存在和不存在的情況下,用范圍在10-100μM之間的不同濃度的DMF處理細胞。然后分別在1%或21%氧張力下進行不同時間的預處理(1-24小時),用含有0.1% FBS和1%P/S的a-MEM更換培養(yǎng)基。對于環(huán)境(21%)氧張力實驗,細胞在濕潤的培養(yǎng)箱中,37℃,95%空氣,5% CO2的條件下培養(yǎng)。對于缺氧實驗,細胞在濕潤的培養(yǎng)箱中,370C,5% CO2,氧張力降到1%,補充N2的條件下培養(yǎng)。通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)合成的cDNA對MC3T3 El細胞中VEGF和IL-8的表達進行研究。使用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、免疫沉淀和Western免疫印跡分析測定蛋白質濃度,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測VEGF, IL-8,采用HIF-1α脈沖標記方法對放射性標記的HIF-1α蛋白質進行SDS-PAGE電泳,使用HydroTech干膠設備(Bio-Rad Laboratories, USA)干膠,然后放射自顯影。通過上述方法探討富馬酸二甲酯(DMF)對HIF-1α表達和功能的影響,對HIF-1α及其目標基因表達及影響。結果：在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),DMF可以抑制成骨細胞中因缺氧誘導的HIF-1α及其目標基因,如白介素8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在M℃3T3E1細胞中的表達。DMF以蛋白酶依賴、von Hippel-Lindau (VHL)蛋白不依賴的方式促進HIF-1α的降解。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)DMF打斷HIF-1α和它的分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)之間的相互作用,但可以促進HIF-1α和激活的蛋白酶C (RACK1)受體之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)顯示,DMF可能通過影響HIF-1α蛋白的折疊和成熟從而促進其降解。結論：HIF-1α在成骨細胞缺氧中表達明顯增高。DMF是一種新型的HIF-1α抑制劑,它可通過改變與伴侶蛋白Hsp90和RACK1的功能性相互作用來抑制成骨細胞中的HIF-1α。我們的研究讓人們對DMF在骨折及骨質疏松癥成骨細胞缺氧過程中的藥理作用有了更深一步的了解。為治療骨折及骨質疏松癥提供了一種新的思路。第二部分富馬酸二甲酯對椎間盤髓核中低氧誘導因子-1a分泌及表達的影響研究背景：眾多的研究結果證明是椎間盤退變是脊柱退變的始動因素,因此研究椎間盤退變的病理、生理改變是我們解決是脊柱退行性疾病的關鍵。然而,目前研究多集中于生物力學因素、生理、生化因素、機體免疫、細胞因子、炎癥介質等多方面的研究,然而其確切機制發(fā)病機制尚無定論。上述各種因素會導致椎間盤內(nèi)蛋白多糖含量減少、髓核細胞凋亡、新生血管的形成等等,而這些被普遍認為在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用。HIF-1a是一種使組織細胞適應低氧環(huán)境的重要分子,是機體在低氧狀態(tài)下調劑機體功能的一種重要氧依賴轉錄激活因子。其可以促進血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖受體及促紅細胞生成素(EPO)生成,激活炎癥因子的表達,誘導泡沫細胞的形成,調控細胞的凋亡及分化�，F(xiàn)已證明,缺氧可以上調幾個重要基因的表達,包括可以促進新血管的形成和介導炎癥反應的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細胞介素-8 (IL-8)。HIF-1α的蛋白質水平通過可控的蛋白質水解作用受到氧張力的嚴格調控先前的實驗研究表明免疫組化的方法證實,HIF-1α的表達在突出椎間盤要明顯高于正常椎間盤,表達程度與細胞凋亡之間存在正相關性,髓核內(nèi)HIF-1a的表達會伴隨椎間盤髓核組織破壞程度的增加相應升高。我們根據(jù)自己第一部分的研究結果已經(jīng)證實DMF是一種新型的HIF-1α抑制劑,本實驗決定進一步檢測新型HIF-1α抑制劑富馬酸二甲酯對其在椎間盤退變過程中的影響。因此探討HIF-1α在退變椎間盤組織內(nèi)的表達以及富馬酸二甲酯對其表達的影響,對于步揭示和完善椎間盤退變的機制,以及對于椎間盤退變的預防和治療意義重人目的：建立SD大鼠腰椎間盤退變動物模型,在此基礎上采用影MRI、組織學驗證退變模型的可靠性,免疫組織化學、免疫印跡等實驗方法測定HIF-1α在椎間盤髓核中的表達及作用,探討富馬酸二甲酯對其表達及分泌的影響。方法：實驗研究對象為SD大鼠,48只大鼠按照設計隨機分為三組,正常對照組A組(無任何干預措施)、模型對照組B組(單純行動物模型處理)、模型實驗組富馬酸二甲酯組C組(建立模型后口服富馬酸二甲酯),每組16只。實驗組采用手術方式建立實驗模型：麻醉成功后切除L1-L6棘上韌帶、棘間韌帶及兩側豎棘肌,咬骨鉗咬除棘突、關節(jié)突,建立腰椎間盤退變的實驗動物模型。動物實驗模型建立術后2周開始給藥,富馬酸二甲酯組C組給予50mg/kg/d灌胃給藥,持續(xù)給藥6周,模型對照組B組給予等體積的生理鹽水,正常對照組A組未行任何干預措施。于術后8周將全部的SD大鼠麻醉后行腰椎MRI掃描,掃描后使用組織病理、免疫組織化學及免疫印跡等實驗方法對椎間盤組織進行檢測。結果：通過此種手術方法建立腰椎間盤退變動物模型確實可靠,MRI顯示模型對照組及富馬酸二甲酯椎間盤退變明顯,T2信號減低,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。組織病理學結果顯示模型對照組,外周纖維環(huán)出現(xiàn)纖維樣變,髓核細胞的數(shù)目減少,終板退變。透射電鏡下觀察結果顯示實驗組中較對照組髓核細胞數(shù)目明顯減少,細胞突起減少或消失,糖原顆粒及細胞器數(shù)目在細胞內(nèi)的表達明顯減少,膠原原纖維發(fā)生變性、融合,甚至鈣化。免疫組化顯示椎間盤髓核組織中富馬酸二甲酯組HIF-1a表達呈陽性,與模型對照組及正常對照組有顯著性差異(P0.05)。蛋白印跡檢測結果富馬酸二甲酯組HIF-1a表達水平較模型對照組低,有顯著性差異(P0.05)。結論：HIF-1在退變的腰椎間盤組織中表達增高,其表達與腰椎的退變密切相關。富馬酸二甲酯作為HIF-1a的抑制劑能降低HIF-1a的表達,抑制和延緩腰椎間盤退變的形成和發(fā)展。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53

【參考文獻】

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1 王俊豐;賈長青;劉洪亮;劉振寧;韓長旭;;缺氧誘導因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子在突出腰椎間盤中的表達及意義[J];中國組織化學與細胞化學雜志;2008年01期

2 西永明,胡有谷;椎間盤退變模型的建立及其歷史和現(xiàn)狀[J];中華骨科雜志;2000年06期

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本文編號：1579035