本文選題：富馬酸二甲酯　切入點(diǎn)：缺氧　出處：《山東大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：研究已經(jīng)表明,骨折和骨骼的失載荷(失重力)能誘導(dǎo)骨細(xì)胞缺氧。現(xiàn)已證明,其中,低氧誘導(dǎo)因子-1a (HIF-1a)是一種組織細(xì)胞低氧環(huán)境的分泌表達(dá)的重要分子,可以誘導(dǎo)多種炎性介質(zhì)的表達(dá),是機(jī)體在低氧狀態(tài)下調(diào)劑機(jī)體功能的一種重要氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子,介導(dǎo)骨折及骨骼失載荷中多種炎性因子的釋放,對于骨折愈合及骨質(zhì)疏松是一種不利因素。其可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF).葡萄糖受體及促紅細(xì)胞生成素(EPO)生成,激活炎癥因子的表達(dá),誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成,調(diào)控細(xì)胞的凋亡及分化。現(xiàn)已證明,缺氧可以上調(diào)幾個重要基因的表達(dá),包括可以促進(jìn)新血管的形成和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細(xì)胞介素-8(IL-8)。椎間盤退變亦能出現(xiàn)HIF-1α的高表達(dá)。富馬酸二甲酯(DMF)是最近批準(zhǔn)的用于多發(fā)性硬化癥的一線治療藥物,它有良好的特征性的保護(hù)神經(jīng)、保護(hù)細(xì)胞作用。DMF可以調(diào)節(jié)不同類型的細(xì)胞中的免疫系統(tǒng)；是一種口服片劑,人們認(rèn)為它是通過降低NF-κB依賴的基因的表達(dá)起作用的。缺氧時都會發(fā)生促炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,但是,有關(guān)DMF在缺氧時的生理作用,尤其是對HIF-1α的表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)方面的信息在過往研究中卻鮮有報道。本研究中,我們期待證明DMF是一種新型的HIF-1α表達(dá)功能抑制劑。進(jìn)而對于骨折、骨質(zhì)疏松、椎間盤退變的治療提出-種新的思路。我們實(shí)驗(yàn)分成兩部分來進(jìn)行：一、富馬酸二甲酯抑制成骨細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)及其功能。富馬酸二甲酯對椎間盤髓核中低氧誘導(dǎo)因子-la分泌及表達(dá)的影響。第一部分富馬酸二甲酯抑制成骨細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1α (HIF-1α)的表達(dá)及其功能目的：探討富馬酸二甲酯(DMF)在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞HIF-lα表達(dá)和功能中所起的功能和作用。方法：在添加了10%胎牛血清(FBS)和1%青霉素和鏈霉素(P/S)的α-基礎(chǔ)培養(yǎng)基(α-MEM)中培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1(克降14)。缺氧處理前分別在蛋白酶體抑制劑MG132或N-乙酰基-亮氨酰-亮氨酰-正亮氨酸(N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, ALLN)存在和不存在的情況下,用范圍在10-100μM之間的不同濃度的DMF處理細(xì)胞。然后分別在1%或21%氧張力下進(jìn)行不同時間的預(yù)處理(1-24小時),用含有0.1% FBS和1%P/S的a-MEM更換培養(yǎng)基。對于環(huán)境(21%)氧張力實(shí)驗(yàn),細(xì)胞在濕潤的培養(yǎng)箱中,37℃,95%空氣,5% CO2的條件下培養(yǎng)。對于缺氧實(shí)驗(yàn),細(xì)胞在濕潤的培養(yǎng)箱中,370C,5% CO2,氧張力降到1%,補(bǔ)充N2的條件下培養(yǎng)。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)合成的cDNA對MC3T3 El細(xì)胞中VEGF和IL-8的表達(dá)進(jìn)行研究。使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)、免疫沉淀和Western免疫印跡分析測定蛋白質(zhì)濃度,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測VEGF, IL-8,采用HIF-1α脈沖標(biāo)記方法對放射性標(biāo)記的HIF-1α蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳,使用HydroTech干膠設(shè)備(Bio-Rad Laboratories, USA)干膠,然后放射自顯影。通過上述方法探討富馬酸二甲酯(DMF)對HIF-1α表達(dá)和功能的影響,對HIF-1α及其目標(biāo)基因表達(dá)及影響。結(jié)果：在本研究中,我們發(fā)現(xiàn),DMF可以抑制成骨細(xì)胞中因缺氧誘導(dǎo)的HIF-1α及其目標(biāo)基因,如白介素8(IL-8)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在M℃3T3E1細(xì)胞中的表達(dá)。DMF以蛋白酶依賴、von Hippel-Lindau (VHL)蛋白不依賴的方式促進(jìn)HIF-1α的降解。重要的是,我們發(fā)現(xiàn)DMF打斷HIF-1α和它的分子伴侶熱休克蛋白90(Hsp90)之間的相互作用,但可以促進(jìn)HIF-1α和激活的蛋白酶C (RACK1)受體之間的相互作用。這些數(shù)據(jù)顯示,DMF可能通過影響HIF-1α蛋白的折疊和成熟從而促進(jìn)其降解。結(jié)論：HIF-1α在成骨細(xì)胞缺氧中表達(dá)明顯增高。DMF是一種新型的HIF-1α抑制劑,它可通過改變與伴侶蛋白Hsp90和RACK1的功能性相互作用來抑制成骨細(xì)胞中的HIF-1α。我們的研究讓人們對DMF在骨折及骨質(zhì)疏松癥成骨細(xì)胞缺氧過程中的藥理作用有了更深一步的了解。為治療骨折及骨質(zhì)疏松癥提供了一種新的思路。第二部分富馬酸二甲酯對椎間盤髓核中低氧誘導(dǎo)因子-1a分泌及表達(dá)的影響研究背景：眾多的研究結(jié)果證明是椎間盤退變是脊柱退變的始動因素,因此研究椎間盤退變的病理、生理改變是我們解決是脊柱退行性疾病的關(guān)鍵。然而,目前研究多集中于生物力學(xué)因素、生理、生化因素、機(jī)體免疫、細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)等多方面的研究,然而其確切機(jī)制發(fā)病機(jī)制尚無定論。上述各種因素會導(dǎo)致椎間盤內(nèi)蛋白多糖含量減少、髓核細(xì)胞凋亡、新生血管的形成等等,而這些被普遍認(rèn)為在椎間盤退變過程中發(fā)揮著重要作用。HIF-1a是一種使組織細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要分子,是機(jī)體在低氧狀態(tài)下調(diào)劑機(jī)體功能的一種重要氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子。其可以促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、葡萄糖受體及促紅細(xì)胞生成素(EPO)生成,激活炎癥因子的表達(dá),誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞的形成,調(diào)控細(xì)胞的凋亡及分化�，F(xiàn)已證明,缺氧可以上調(diào)幾個重要基因的表達(dá),包括可以促進(jìn)新血管的形成和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和白細(xì)胞介素-8 (IL-8)。HIF-1α的蛋白質(zhì)水平通過可控的蛋白質(zhì)水解作用受到氧張力的嚴(yán)格調(diào)控先前的實(shí)驗(yàn)研究表明免疫組化的方法證實(shí),HIF-1α的表達(dá)在突出椎間盤要明顯高于正常椎間盤,表達(dá)程度與細(xì)胞凋亡之間存在正相關(guān)性,髓核內(nèi)HIF-1a的表達(dá)會伴隨椎間盤髓核組織破壞程度的增加相應(yīng)升高。我們根據(jù)自己第一部分的研究結(jié)果已經(jīng)證實(shí)DMF是一種新型的HIF-1α抑制劑,本實(shí)驗(yàn)決定進(jìn)一步檢測新型HIF-1α抑制劑富馬酸二甲酯對其在椎間盤退變過程中的影響。因此探討HIF-1α在退變椎間盤組織內(nèi)的表達(dá)以及富馬酸二甲酯對其表達(dá)的影響,對于步揭示和完善椎間盤退變的機(jī)制,以及對于椎間盤退變的預(yù)防和治療意義重人目的：建立SD大鼠腰椎間盤退變動物模型,在此基礎(chǔ)上采用影MRI、組織學(xué)驗(yàn)證退變模型的可靠性,免疫組織化學(xué)、免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法測定HIF-1α在椎間盤髓核中的表達(dá)及作用,探討富馬酸二甲酯對其表達(dá)及分泌的影響。方法：實(shí)驗(yàn)研究對象為SD大鼠,48只大鼠按照設(shè)計隨機(jī)分為三組,正常對照組A組(無任何干預(yù)措施)、模型對照組B組(單純行動物模型處理)、模型實(shí)驗(yàn)組富馬酸二甲酯組C組(建立模型后口服富馬酸二甲酯),每組16只。實(shí)驗(yàn)組采用手術(shù)方式建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停郝樽沓晒笄谐齃1-L6棘上韌帶、棘間韌帶及兩側(cè)豎棘肌,咬骨鉗咬除棘突、關(guān)節(jié)突,建立腰椎間盤退變的實(shí)驗(yàn)動物模型。動物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⑿g(shù)后2周開始給藥,富馬酸二甲酯組C組給予50mg/kg/d灌胃給藥,持續(xù)給藥6周,模型對照組B組給予等體積的生理鹽水,正常對照組A組未行任何干預(yù)措施。于術(shù)后8周將全部的SD大鼠麻醉后行腰椎MRI掃描,掃描后使用組織病理、免疫組織化學(xué)及免疫印跡等實(shí)驗(yàn)方法對椎間盤組織進(jìn)行檢測。結(jié)果：通過此種手術(shù)方法建立腰椎間盤退變動物模型確實(shí)可靠,MRI顯示模型對照組及富馬酸二甲酯椎間盤退變明顯,T2信號減低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。組織病理學(xué)結(jié)果顯示模型對照組,外周纖維環(huán)出現(xiàn)纖維樣變,髓核細(xì)胞的數(shù)目減少,終板退變。透射電鏡下觀察結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組中較對照組髓核細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞突起減少或消失,糖原顆粒及細(xì)胞器數(shù)目在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)明顯減少,膠原原纖維發(fā)生變性、融合,甚至鈣化。免疫組化顯示椎間盤髓核組織中富馬酸二甲酯組HIF-1a表達(dá)呈陽性,與模型對照組及正常對照組有顯著性差異(P0.05)。蛋白印跡檢測結(jié)果富馬酸二甲酯組HIF-1a表達(dá)水平較模型對照組低,有顯著性差異(P0.05)。結(jié)論：HIF-1在退變的腰椎間盤組織中表達(dá)增高,其表達(dá)與腰椎的退變密切相關(guān)。富馬酸二甲酯作為HIF-1a的抑制劑能降低HIF-1a的表達(dá),抑制和延緩腰椎間盤退變的形成和發(fā)展。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R681.53

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王俊豐;賈長青;劉洪亮;劉振寧;韓長旭;;缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子在突出腰椎間盤中的表達(dá)及意義[J];中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志;2008年01期

2 西永明,胡有谷;椎間盤退變模型的建立及其歷史和現(xiàn)狀[J];中華骨科雜志;2000年06期

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本文編號：1579035