本文關(guān)鍵詞： 雙酚A PRL瘤 細(xì)胞增殖 雌二醇 雌激素受體　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景垂體瘤是顱內(nèi)常見腫瘤,約占顱內(nèi)腫瘤的15%。在普通人群中,垂體微腺瘤的臨床檢出率達(dá)10-25%。對(duì)歐洲、南美的垂體腺瘤流行病學(xué)研究顯示垂體瘤發(fā)病率較之前報(bào)道增長(zhǎng)了3-5倍。在各種垂體腺瘤中,泌乳素腺瘤所占比例最高達(dá)66.2%。其所伴發(fā)的內(nèi)分泌紊亂如高泌乳素(Prolactin, PRL)血癥、異常閉經(jīng)、泌乳、不孕等以及巨大瘤體對(duì)中樞其它部位的壓迫,嚴(yán)重威脅著患者的身心健康。雖然溴隱亭以及近年出現(xiàn)的培高利特和卡麥角林等新型多巴胺受體激動(dòng)劑可使80%以上的PRL瘤患者的血清PRL降至正常,但部分瘤體對(duì)多巴胺激動(dòng)劑不敏感、以及停藥后復(fù)發(fā)的問題仍十分顯著。PRL瘤的發(fā)生與多種因素有關(guān),近年來研究表明雌激素參與垂體瘤的發(fā)生發(fā)展過程,在F344大鼠PRL瘤模型中,雌激素受體拮抗劑氟維司群能夠有效抑制PRL瘤的增長(zhǎng)。雙酚A (Bisphenol A, BPA)是世界上產(chǎn)量最高的化學(xué)原料之一,廣泛應(yīng)用于聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的制造。動(dòng)物試驗(yàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)BPA有模擬雌激素的效果,在胎兒發(fā)育階段暴露于不同劑量BPA時(shí),會(huì)在生長(zhǎng)發(fā)育過程中加快動(dòng)物發(fā)情,導(dǎo)致前列腺生長(zhǎng),改變青春期乳腺發(fā)育,永久性改變小鼠的雌性生殖道和卵巢的形態(tài)與功能。近年來研究發(fā)現(xiàn),BPA可顯著增加乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌等腫瘤的發(fā)病率。研究發(fā)現(xiàn)BPA可通過與雌激素受體α (estrogen receptor alpha, ERα)雌激素受體β (estrogen receptor beta, ER β)及其它非基因組途徑作用于乳腺、子宮內(nèi)膜細(xì)胞,誘發(fā)乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌,但具體機(jī)制不明。細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)BPA可通過促進(jìn)垂體細(xì)胞的鈣內(nèi)流,促進(jìn)PRL的釋放,但在體內(nèi)研究中,長(zhǎng)期的BPA暴露能否導(dǎo)致PRL瘤的發(fā)生以及BPA與垂體細(xì)胞ERα、ERβ表達(dá)的關(guān)系尚不明確。在臨床上,泌乳瘤的發(fā)生是否與過量暴露BPA有關(guān),并無相關(guān)報(bào)道。PRL瘤發(fā)病率增加的原因是什么?與日益加重的環(huán)境污染特別是廣泛應(yīng)用的工業(yè)化合物如環(huán)境內(nèi)分泌干擾物BPA是否有關(guān)?這是我們感興趣的問題,揭示雙酚A與PRL瘤的關(guān)系,并探索其潛在機(jī)制將對(duì)此病的預(yù)防及我國(guó)BPA產(chǎn)品使用,法規(guī)的制定提供一定的理論依據(jù)。目的研究不同濃度BPA對(duì)F344大鼠垂體細(xì)胞增殖與功能的影響,結(jié)合PRL瘤病人與健康人群血清及尿液BPA濃度測(cè)定的比較,探討B(tài)PA與PRL瘤發(fā)生的相關(guān)性及其潛在機(jī)制,為PRL瘤的防治、我國(guó)雙酚A產(chǎn)品的使用提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法實(shí)驗(yàn)分為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分及臨床實(shí)驗(yàn)部分。1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分4周齡雌性F344大鼠60只,根據(jù)完全隨機(jī)分組法分為6組：正常對(duì)照組(ctrl)、溶劑玉米油組(ctrl (oil)、 BPA給藥組和苯甲酸雌二醇(estradiol benzoate, E2)陽性對(duì)照組。BPA按體質(zhì)量(BW)每日玉米油溶解后灌胃,分為BPA50mg/kg/d (BPA50)組、BPA200mg/kg/d(BPA200)組、BPA400mg/kg/d(BPA400)組。苯甲酸雌二醇(E2)2mg/kg/5d腹腔內(nèi)注射給藥。每組10只,觀察并記錄大鼠體重變化及一般情況。藥物干預(yù)6周后經(jīng)眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血行血清PRL(prolactin,PRL)測(cè)定,藥物干預(yù)12周時(shí)每組隨機(jī)抽取2只大鼠,水合氯醛麻醉大鼠,行頭顱磁共振(Magnetic resonance, MR)平掃+動(dòng)態(tài)增強(qiáng)掃描,從影像學(xué)上觀察垂體大小,有無垂體瘤的發(fā)生。藥物干預(yù)12周后處死大鼠,留取血清,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunoSorbent assay, ELISA)測(cè)大鼠血清PRL、生長(zhǎng)激素(growth hormone, GH)、促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotrophic hormone, ACTH)、促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)水平。稱取垂體質(zhì)量,并將垂體分為兩部分,一部分固定于福爾馬林,常規(guī)脫水、石蠟包埋、制作石蠟切片行蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin,HE)染色及增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)PRL、ERα的免疫組化,另外一部分液氮保存,western blot法行垂體腫瘤轉(zhuǎn)化基因(pituitary tumor-transforming gene, PTTG)、PCNA、ERα、ERβ蛋白水平測(cè)定,RT-PCR法行PCNA、PTTG、ERα、ERβ基因水平的研究。2.臨床實(shí)驗(yàn)部分收集從2015年3月到2015年12月于山東大學(xué)齊魯醫(yī)院就診的PRL瘤患者的血清和中段尿,正常對(duì)照組為濟(jì)南市健康查體人群的血清和中段尿。研究對(duì)象分為兩組：PRL瘤組60例,女54例,男6例,年齡21歲-55歲,平均年齡33.20±9.14歲；正常對(duì)照組60例,女53例,男7例,年齡20歲-55歲,平均年齡33.76±9.22歲,采用液相色譜法測(cè)定血清和尿液中BPA含量。3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料分析采用Fisher確切概率法。計(jì)量資料以x±s表示,多組比較方差齊時(shí)采用單因素方差分析,方差不齊時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。兩兩比較采用t檢驗(yàn)；顯著性差異的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定為α=0.05,即認(rèn)為P0.05時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1.大鼠一般狀況正常對(duì)照組及玉米油組：大鼠精神狀態(tài)較好,反應(yīng)靈敏,體毛均勻,發(fā)育正常。BPA及E2用藥各組精神狀態(tài)差,反應(yīng)遲鈍,有不同程度體毛脫落,其中E2組脫毛最明顯,BPA400組次之。2.大鼠體質(zhì)量藥物干預(yù)12周后BPA實(shí)驗(yàn)組大鼠的平均體質(zhì)量(Body weight, BW)小于對(duì)照組,BPA200、BPA400組大鼠BW較對(duì)照組顯著降低(P0.05)。BPA 50組和E2組與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.大鼠垂體MRBPA 50、BPA400組及E2組垂體較對(duì)照組明顯增大,BPA200組與ctrl、oil組無明顯差異。4.大鼠垂體質(zhì)量(mg)BPA 50、BPA400組及E2組垂體質(zhì)量較對(duì)照組顯著升高(P0.05),BPA200組、ctrl組、oil組比較組間平均垂體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.大鼠血清PRL、GH、ACTH、TSH水平藥物干預(yù)6W后BPA各組及E2組大鼠血清PRL水平較ctrl組、oil組顯著升高(P0.05),E2組PRL水平最高。藥物干預(yù)12W后,各組PRL水平與ctrl組、oil組比較進(jìn)一步升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。藥物干預(yù)12W后,BPA50組血清GH水平與ctrl組、oil組相比明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而BPA400組GH水平較ctrl組、oil組明顯降低.有顯著性差異。BPA各組及E2組血清ACTH、TSH水平與ctrl組、oil組比較無顯著性差異,P0.05。6.大鼠垂體HE染色ctrl組、oil組大鼠垂體組織均未見明顯異常(0/10),而BPA50組有4只(4/10),BPA400組有3只(3/9)大鼠垂體組織發(fā)生腫瘤樣改變,BPA200組僅有1只(1/9)大鼠垂體組織發(fā)生腫瘤樣改變,E2組垂體組織100%發(fā)生腫瘤樣改變。7.大鼠垂體PRL、PCNA、ER α免疫組化結(jié)果7.1 BPA50、200、400及E2組垂體PRL免疫組化評(píng)分顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.2 BPA50、200、400及E2組垂體PCNA免疫組化評(píng)分顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)7.3 BPA50組垂體ER α表達(dá)增加,高于ctrl組及oi1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但BPA200、400及E2組ER α免疫組化評(píng)分與Ctrl組及Ctrl (Oil)組相比無顯著差異(P0.05)。8.大鼠垂體PCNA、PTTG、ERα、ERβwestern blot結(jié)果8.1 BPA50、400及E2組PCNA蛋白表達(dá)明顯高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),BPA200組PCNA蛋白表達(dá)與ctrl組及oil組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.2BPA50、400及E2組PTTG蛋白表達(dá)顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),BPA200組PTTG蛋白表達(dá)與ctrl組及oil組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。8.3BPA50、E2組ER α表達(dá)顯著增加,高于ctrl組及oi1組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但BPA200、400,組ER α表達(dá)與ctrl組及oil組相比無顯著差異(P0.05)。8.4BPA50、BPA200組ER β表達(dá)顯著增加,高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但BPA400,組、E2組ER β表達(dá)與ctrl組及oil組相比無顯著差異(P0.05)。9.大鼠垂體PCNA、PTTG, ERa、ERβ的RT-PCR結(jié)果9.1 BPA50、200、400及E2組PCNA mRNA顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ctrl組與oil組比較PCNA mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.2 BPA50、200、400及E2組PTTG mRNA顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),ctrl組與oil組比較PCNA mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.3 BPA50、400及E2組ERα mRNA顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但BPA200組ER α表達(dá)與ctrl組及oil組相比無顯著差異(P0.05)。9.4 BPA50、200及E2組ERβmRNA顯著高于ctrl組及oil組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但BPA400組ERβmRNA與ctrl組及oil組相比明顯下降(P0.05)。10.PRL瘤組與健康對(duì)照組血清及尿液雙酚A測(cè)定結(jié)果10.1血清BPA水平：PRL瘤組血清BPA水平為7.10±4.08 ng/ml,健康對(duì)照組血清BPA水平為4.30±3.14 ng/ml,PRL瘤組血清BPA水平顯著高于健康對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。10.2尿液BPA水平：PRL瘤組尿液BPA水平為3.69±3.47 ng/ml,健康對(duì)照組尿液BPA水平為3.71±4.01 ng/m1,兩組無顯著性差異(P0.05)。結(jié)論1.一定濃度的BPA可顯著促進(jìn)大鼠垂體細(xì)胞增殖,并促進(jìn)PRL分泌,促進(jìn)PRL瘤的形成。2.一定濃度的BPA可能是通過ER α等基因組途徑影響垂體細(xì)胞的增殖與分泌功能。3.人類PRL瘤患者血清中BPA水平增高,BPA可能參與了PRL瘤的發(fā)生過程。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R736.4

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