本文關(guān)鍵詞： 集群鈣信號(hào) 小鼠 光纖 初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層 初級(jí)視覺皮層 自由運(yùn)動(dòng) 膀胱 排尿　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：運(yùn)動(dòng)是機(jī)體一項(xiàng)復(fù)雜的行為活動(dòng),需要多個(gè)腦區(qū)共同參與。其中,運(yùn)動(dòng)皮層是運(yùn)動(dòng)控制的高級(jí)中樞,在運(yùn)動(dòng)的準(zhǔn)備和執(zhí)行等環(huán)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M1)是運(yùn)動(dòng)皮層的核心區(qū)域,其內(nèi)第5層椎體神經(jīng)元與脊髓存在大量的神經(jīng)聯(lián)系,可以直接向脊髓下達(dá)運(yùn)動(dòng)指令并控制運(yùn)動(dòng)的執(zhí)行。視覺皮層是調(diào)控機(jī)體運(yùn)動(dòng)行為的另一個(gè)重要腦區(qū),與運(yùn)動(dòng)皮層有著大量的神經(jīng)聯(lián)系。其中的初級(jí)視覺皮層(V1)接受來自外界環(huán)境的視覺輸入,對(duì)個(gè)體的自身定位和運(yùn)動(dòng)行為的指引有重要意義。然而目前,兩個(gè)皮層在運(yùn)動(dòng)過程中對(duì)信息處理和編碼的機(jī)制仍不清楚。排尿行為不僅是人和動(dòng)物的一項(xiàng)基本生理功能,也是一項(xiàng)復(fù)雜社會(huì)行為,它涉及膀胱的兩個(gè)過程:儲(chǔ)存和排空。排尿反射是膀胱的排空過程中的關(guān)鍵關(guān)節(jié),需要神經(jīng)系統(tǒng)中的多個(gè)區(qū)域的共同調(diào)控。排尿反射是一條由脊髓-延髓-脊髓介導(dǎo)的神經(jīng)環(huán)路,環(huán)路上有一個(gè)關(guān)鍵性的腦區(qū)腦橋排尿中樞(PMC)。腦橋排尿中樞是目前研究明確所知的控制排尿的中樞區(qū)域。它的激活會(huì)引起尿道膀胱逼尿肌收縮、平滑肌的松弛進(jìn)而使尿液流出膀胱。但是,排尿行為作為一種高度可控的行為,還應(yīng)該受到更高級(jí)中樞的控制,如大腦皮層。但目前的研究尚未發(fā)現(xiàn)有確切控制排尿功能的皮層區(qū)域。傳統(tǒng)的用于研究皮層信息編碼和處理的方法是監(jiān)測單個(gè)神經(jīng)元的活動(dòng)。然而,長期以來,研究神經(jīng)元集群的活動(dòng)是另一種解析皮層的工作模式的重要方式。大量研究已經(jīng)證明,集群的神經(jīng)元活動(dòng)參與腦的多種功能并扮演重要角色,如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、感覺信息處理以及學(xué)習(xí)和記憶等。常用的監(jiān)測腦集群神經(jīng)活動(dòng)的方法有局部場電位、功能磁共振和雙光子鈣成像等。但以上方法存在空間分別率不足、成像深度過淺或者不能在自由清醒動(dòng)物身上記錄等限制。近幾年,一種名為光纖記錄的集群鈣信號(hào)記錄方法得到了快速發(fā)展和應(yīng)用。它是一種操作方便、高效、可用于自由運(yùn)動(dòng)動(dòng)物深部腦區(qū)記錄的鈣信號(hào)監(jiān)測方法。綜合以上信息,在本文中我們采用光纖記錄的方法,監(jiān)測運(yùn)動(dòng)和排尿行為過程中動(dòng)物大腦皮層集群神經(jīng)元的鈣活動(dòng)情況,試圖解析皮層在運(yùn)動(dòng)和排尿過程中信息處理和編碼的神經(jīng)機(jī)制。本文主要發(fā)現(xiàn)如下:1.不同麻醉深度對(duì)小鼠大腦皮層集群鈣信號(hào)的影響。麻醉對(duì)大腦活動(dòng)狀態(tài)的影響涉及多個(gè)層次,小至單個(gè)神經(jīng)元大到全腦水平,但麻醉對(duì)小規(guī)模局部神經(jīng)元集群的影響仍所知甚少。因此,在本文中我們選取初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M1)和初級(jí)視覺皮層(V1)作為研究區(qū)域。我們?cè)贛1區(qū)或V1區(qū)第5層注射鈣染料OGB-1AM,并用光纖記錄注射區(qū)域的鈣信號(hào)變化。在M1區(qū),我們分別在5個(gè)不同的麻醉深度(2%, 1.5%, 1.2%, 1%, 0.8%)下進(jìn)行了鈣信號(hào)記錄,而在V1區(qū),我們僅在0.8%深度下進(jìn)行了記錄。(1)不同麻醉深度對(duì)皮層集群鈣信號(hào)頻率特征的影響。隨著麻醉濃度的降低,M1區(qū)的鈣信號(hào)的發(fā)放頻率逐漸升高,從2%的0.044 ±0.013 Hz升高到0.8%的0.477 ± 0.0026 Hz,而且相鄰兩種麻醉深度下的鈣信號(hào)頻率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。相同麻醉深度下,M1區(qū)與V1區(qū)的鈣信號(hào)頻率沒有顯著差別(p = 0.051 )。(2)不同麻醉深度對(duì)皮層集群鈣信號(hào)幅度特征的影響。不同麻醉深度對(duì)鈣信號(hào)幅度的影響則與頻率相反。隨著麻醉濃度的降低,M1區(qū)的鈣信號(hào)幅度也隨之降低,從2%的0.052 ± 0.012 △F/F降低到0.8%的0.016 ± 0.009 △F/F(△F/F代表熒光強(qiáng)度變化),而且相鄰兩種麻醉深度下的鈣信號(hào)幅度有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。同樣的,M1區(qū)與V1區(qū)的鈣信號(hào)幅度在相同麻醉深度下沒有差別(p = 0.883)。(3)不同麻醉深度對(duì)皮層集群鈣信號(hào)上升時(shí)間的影響。鈣信號(hào)的上升時(shí)間非常穩(wěn)定,既不會(huì)被麻醉的變化所影響,也不會(huì)受到不同腦區(qū)的影響。具體結(jié)果如下:在M1區(qū),麻醉濃度下降,上升時(shí)間沒有明顯變化,始終處于0.174 s左右。而0.8%麻醉深度下V1區(qū)鈣信號(hào)的上升時(shí)間是0.170 s。綜合分析M1和V1的6組數(shù)據(jù),沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.320)。上述結(jié)果表明,皮層集群鈣信號(hào)的特征與麻醉深度密切相關(guān),信號(hào)頻率和幅度表現(xiàn)出明顯的濃度依賴特性,而上升時(shí)間則與麻醉深度沒有明顯關(guān)聯(lián)。此外,不同皮層的集群鈣信號(hào)在相同的麻醉深度下沒有明顯差別。2.自由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下M1區(qū)集群鈣信號(hào)特點(diǎn)。接下來,我們又記錄了清醒小鼠自由運(yùn)動(dòng)情況下的M1區(qū)集群鈣信號(hào),比較了運(yùn)動(dòng)與靜止?fàn)顟B(tài)鈣信號(hào)的特點(diǎn),同時(shí)分析了鈣信號(hào)與運(yùn)動(dòng)的相關(guān)性。(1)運(yùn)動(dòng)與靜止?fàn)顟B(tài)下集群鈣信號(hào)特點(diǎn)不同。我們?nèi)匀贿x取M1區(qū)第5層作為記錄位點(diǎn),待小鼠光纖埋置完畢且麻醉效果已基本消退后,將小鼠放入白色矩形的盒內(nèi)進(jìn)行鈣信號(hào)與行為學(xué)的同步記錄。通過分析小鼠運(yùn)動(dòng)幅度和鈣信號(hào),我們發(fā)現(xiàn):當(dāng)小鼠處于清醒自由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)時(shí),可記錄到高頻發(fā)放的鈣信號(hào)(0.42 ±0.04 Hz),且幅度較大(1.51% ±0.06% △F/F);當(dāng)小鼠處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)(但不是睡眠狀態(tài)),僅有很少信號(hào)被記錄到(0.08 ± 0.01 Hz),且幅度較小(0.24% ±0.02% △F/F)。在運(yùn)動(dòng)與靜止?fàn)顟B(tài)下,鈣信號(hào)的頻率和幅度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p 0.001)。為了排除運(yùn)動(dòng)噪聲的影響,我們又在Thy1-GFP轉(zhuǎn)基因小鼠M1區(qū)的第5層進(jìn)行了運(yùn)動(dòng)與熒光強(qiáng)度的同步記錄,結(jié)果顯示當(dāng)小鼠運(yùn)動(dòng)時(shí),熒光強(qiáng)度只有很小的變化,將OGB-1AM與GFP的熒光強(qiáng)度的分布進(jìn)行高斯擬合,擬合優(yōu)度均大于99%,平均值分別為0.3% △F/F和1.5% △F/F,這些結(jié)果表明我們記錄到的熒光變化不是運(yùn)動(dòng)噪聲,而是真正的鈣信號(hào)。(2) M1區(qū)集群鈣信號(hào)與小鼠運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)。我們進(jìn)一步分析了運(yùn)動(dòng)與鈣信號(hào)的關(guān)聯(lián)性。結(jié)果顯示:每一個(gè)動(dòng)作必然會(huì)伴有相應(yīng)的鈣信號(hào)�；ハ嚓P(guān)分析發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)與鈣信號(hào)高度相關(guān)(P 0.05),而且鈣信號(hào)的起始總是超前于運(yùn)動(dòng)的起始,超前時(shí)間為149.7 ±10.3 ms。將所有超前時(shí)間進(jìn)行高斯擬合,得到擬合中位數(shù)約136 ms (n = 8)。上述結(jié)果表明,M1區(qū)是與運(yùn)動(dòng)行為高度相關(guān)的腦區(qū),其集群鈣信號(hào)反應(yīng)動(dòng)物的運(yùn)動(dòng)行為并超前于運(yùn)動(dòng)。3.自由運(yùn)動(dòng)狀態(tài)下V1區(qū)集群鈣信號(hào)特點(diǎn)。以往的研究顯示,動(dòng)物在運(yùn)動(dòng)過程中需要視覺信息的輸入來進(jìn)行引導(dǎo),而且視覺皮層的神經(jīng)元活動(dòng)也會(huì)受到運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。因此,我們猜想在小鼠V1區(qū)也可能存在運(yùn)動(dòng)相關(guān)的鈣信號(hào)。(1)運(yùn)動(dòng)與V1區(qū)集群鈣信號(hào)密切相關(guān)。我們同樣在V1區(qū)的第5層注射OGB-1AM并記錄鈣信號(hào)。結(jié)果顯示,在V1區(qū)同樣存在與M1區(qū)相似的與運(yùn)動(dòng)高度相關(guān)的、并且超前于運(yùn)動(dòng)的鈣信號(hào)。然而,這種V1區(qū)運(yùn)動(dòng)相關(guān)的鈣信號(hào)要晚于M1區(qū),兩者有顯著性差異(M1: 149.7 ± 10.3 ms versus V1:50.0±4.7 ms;p0.001)。同時(shí),我們分析了這兩個(gè)腦區(qū)鈣信號(hào)的幅度,發(fā)現(xiàn)它們并沒有差別(p=0.0854)。值得一提的是,在黑暗環(huán)境中V1區(qū)運(yùn)動(dòng)相關(guān)的鈣信號(hào)仍然存在,但是其幅度和運(yùn)動(dòng)關(guān)聯(lián)性有所降低(n = 6,p0.001)。(2) M1區(qū)和V1區(qū)第5層集群鈣信號(hào)與頭部運(yùn)動(dòng)高度相關(guān)。人或動(dòng)物要想朝著一個(gè)目標(biāo)進(jìn)行運(yùn)動(dòng),必須獲取自身位置和目標(biāo)方向。而在運(yùn)動(dòng)過程中,頭部運(yùn)動(dòng)是感知方向的關(guān)鍵因素。因此,我們猜想頭部運(yùn)動(dòng)可能與M1區(qū)和V1區(qū)第5層的集群鈣信號(hào)密切相關(guān)。我們分析了三種頭部運(yùn)動(dòng):抬頭、轉(zhuǎn)頭和縮頭。發(fā)現(xiàn):無論哪種頭部運(yùn)動(dòng)發(fā)生,都伴有鈣信號(hào)的產(chǎn)生。這種鈣信號(hào)有以下幾個(gè)特點(diǎn):在M1區(qū)和V1區(qū)均能觀察到這種鈣信號(hào);頭部運(yùn)動(dòng)必然伴有鈣信號(hào),相關(guān)率為100%;三種不同頭部運(yùn)動(dòng)相關(guān)的鈣信號(hào)幅度沒有顯著性差別(M1:p=0.066,n=8; V1: p = 0.181,n = 7)。以上結(jié)果表明V1區(qū)是另一個(gè)與運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)的重要腦區(qū),其神經(jīng)活動(dòng)可能是視覺輸入和運(yùn)動(dòng)輸入的綜合體現(xiàn)。頭部運(yùn)動(dòng)是整個(gè)運(yùn)動(dòng)過程的重要環(huán)節(jié),與M1區(qū)和V1區(qū)的神經(jīng)活動(dòng)緊密相關(guān)。4.膀胱的中樞控制區(qū)域探索。目前的研究結(jié)果顯示排尿的控制中樞位于腦橋排尿中心(PMC),然而,是否存在更高級(jí)的控制中樞(如大腦皮層)參與排尿的控制,現(xiàn)在仍然沒有直接的證據(jù)。因此,我們通過在小鼠膀胱壁注射經(jīng)典的、逆行跨多級(jí)神經(jīng)元的示蹤病毒——偽狂犬病毒(PRV),來探索可以與膀胱形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接的皮層區(qū)域。(1) PRV在小鼠膀胱的標(biāo)記情況小鼠在病毒注射4-5天后,會(huì)表現(xiàn)出明顯的神經(jīng)系統(tǒng)中毒癥狀,如甩尾、啃咬尾部、行動(dòng)搖擺等。此時(shí)將小鼠膀胱、脊髓和腦組織取出,并切片、染色和成像從而獲取形態(tài)學(xué)結(jié)果。在完整的膀胱組織及其切片上,我們可以觀察到被PRV標(biāo)記的神經(jīng)纖維。這說明我們運(yùn)用神經(jīng)示蹤方法成功地標(biāo)記了膀胱壁內(nèi)的神經(jīng)纖維。(2) PRV在小鼠脊髓和其他皮層下腦區(qū)的標(biāo)記情況然后,我們又對(duì)脊髓和腦組織進(jìn)行切片觀察,在腰髓和骶髓副交感神經(jīng)核(SPN)、腦橋排尿中樞(PMC)、藍(lán)斑核(LC)、中腦導(dǎo)水管灰質(zhì)(PAG)以及下丘腦室旁核(PVN)等均發(fā)現(xiàn)了被PRV標(biāo)記的神經(jīng)元,這些腦區(qū)和核團(tuán)與已經(jīng)研究報(bào)道的、公認(rèn)的排尿控制相關(guān)的區(qū)域相一致。以上結(jié)果證明,我們的病毒標(biāo)記方法是可用而有效的。(3) PRV在小鼠大腦皮層的表達(dá)情況更重要的是,我們?cè)谛∈蟮拇竽X皮層也發(fā)現(xiàn)了被PRV標(biāo)記的一群神經(jīng)元,通過與經(jīng)典的小鼠腦圖譜對(duì)比,顯示它們位于初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層(M1)和初級(jí)體感皮層(S1)。統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),被標(biāo)記的神經(jīng)元集群在小鼠大腦皮層前后跨度約為1 mm,并且以前囟(Bregma)向后0.94 mm附近的皮層區(qū)域最為密集。被標(biāo)記的皮層神經(jīng)元總數(shù)量約為1000個(gè);形態(tài)上顯示大部分為椎體神經(jīng)元,且80%以上均位于皮層的第5層。5.小鼠大腦皮層排尿行為相關(guān)鈣信號(hào)的記錄。雖然我們明確了膀胱與M1區(qū)和S1區(qū)之間存在神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系,但這兩個(gè)腦區(qū)在排尿過程中的具體功能仍有待研究。因此我們采用光纖記錄的方法,探究這兩個(gè)腦區(qū)在排尿過程中的神經(jīng)活動(dòng)。(1) M1區(qū)神經(jīng)元鈣信號(hào)與排尿行為密切相關(guān)。我們分別對(duì)清醒自由運(yùn)動(dòng)小鼠鈣染料標(biāo)記后的M1區(qū)與S1區(qū)第5層神經(jīng)元進(jìn)行鈣信號(hào)和排尿行為的同步記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在小鼠排尿時(shí),M1區(qū)總會(huì)有記錄到一個(gè)明顯的排尿行為相關(guān)的鈣信號(hào),而這種現(xiàn)象在S1區(qū)沒有發(fā)現(xiàn)。我們又在M1區(qū)的前部Ma區(qū)進(jìn)行對(duì)照記錄,也沒有發(fā)現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象;對(duì)比鈣信號(hào)的幅度發(fā)現(xiàn)M1區(qū)明顯高于S1區(qū)與Ma區(qū)。故這種排尿行為相關(guān)的鈣信號(hào)具有區(qū)域特異性。我們又對(duì)鈣信號(hào)與排尿行為的先后順序進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)鈣信號(hào)的起始總是超前于排尿行為的起始,平均超前時(shí)間約 130 ms。(2) M1區(qū)與經(jīng)典排尿環(huán)路的投射關(guān)系探索上述結(jié)果提示M1區(qū)(第5層神經(jīng)元)可能是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的與排尿行為密切相關(guān)的腦區(qū),但M1區(qū)是如何參與經(jīng)典排尿行為相關(guān)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)依然不明朗。為了明確M1第5層神經(jīng)元調(diào)控膀胱活動(dòng)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ),我們?cè)贛1區(qū)第5層神經(jīng)元分別注射AAV和VSV示蹤病毒(順行跨多級(jí)神經(jīng)元),在腦橋排尿中樞(PMC)發(fā)現(xiàn)了被AAV標(biāo)記的來自M1區(qū)的軸突和被VSV標(biāo)記的神經(jīng)元。該結(jié)果提示M1區(qū)第5層神經(jīng)元與PMC區(qū)有直接的神經(jīng)聯(lián)系。故M1區(qū)很可能通過調(diào)節(jié)腦橋排尿中樞進(jìn)而參與到經(jīng)典的排尿環(huán)路中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：Q42

【參考文獻(xiàn)】

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1 周立;張恒義;;大鼠壓桿行為的運(yùn)動(dòng)皮層局部場電位研究[J];中國應(yīng)用生理學(xué)雜志;2011年01期

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本文編號(hào)：1495254