本文關(guān)鍵詞： 平滑肌細(xì)胞 BK_(Ca) α亞單位 Hirudin HEK 293　出處：《瀘州醫(yī)學(xué)院》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的：大電導(dǎo)鈣激活鉀通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKca)是廣泛分布在血管平滑肌的細(xì)胞(VSMCs)上的一種鉀通道,其具有電導(dǎo)值大、對鈣離子敏感、電壓依賴性等特性,通道通過負(fù)反饋機(jī)制來控制平滑肌細(xì)胞肌源性張力和靜息膜電位去極化程度,而BKca通道的高電導(dǎo)性及在平滑肌細(xì)胞上的高密度表達(dá)決定了它對血管張力的調(diào)節(jié)。通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法在HEK293上轉(zhuǎn)染BKCaα亞單位,用濃度為0.8mg/L G418篩選,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系,在該表達(dá)細(xì)胞上可以記錄到與天然細(xì)胞上電生理特性相似的BKca電流。由此我們建立了BKcaa單克隆HEK293細(xì)胞模型,并在其上研究藥物對該通道的作用機(jī)制。水蛭素(Hirudin, HIR)在中醫(yī)上被認(rèn)為有著逐瘀、通經(jīng)、活血、破血功效,它是由醫(yī)用水蛭唾液腺提取出的多種活性多肽組成,是一種絲氨酸蛋白酶,具有阻止血小板聚集,抗血栓形成的作用。臨床上主要用于治療腦中風(fēng),腫瘤等疾病,但活血作用在組織細(xì)胞和離子通道上鮮有報道,本實驗通過觀察HIR對大鼠腸系膜血管動脈張力的作用及對HEK293上轉(zhuǎn)染的BKca通道作用研究,探討其對血管作用及機(jī)制,為HIR應(yīng)用于臨床提供更多實驗依據(jù)。方法：(1)大鼠血管環(huán)實驗：用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,開腹取出腸系膜,分離出單根的腸系膜動脈,用眼科剪輕輕剔除血管上的脂肪和結(jié)締組織,并將動脈血管剪成2-3mm的血管環(huán),迅速放入含鈣的溶液Ⅰ中,用兩根銀絲穿過剪好的小動脈環(huán),確保兩根銀絲平行并固定在DMT的換能器上,將掛好的血管與張力換能器、生物放大器與生理記錄儀連接,采用Chart7軟件采集數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析,觀察腸系膜血管的活性,并觀察HIR對血管張力的影響以及其作用機(jī)制。(2)單通道膜片鉗實驗：通過脂質(zhì)體Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染BKca表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-BKα,用0.8mg/mlG418篩選出穩(wěn)定表達(dá)的單克隆細(xì)胞系進(jìn)行膜片鉗實驗。其電流信號通過膜片放大器放大,1KHz低通進(jìn)行濾波,再經(jīng)12位A/D、D/A轉(zhuǎn)換器輸入電腦,用pClamp軟件記錄電流,并觀察BKCa電流特征,以及HIR對BKCa電流的作用。結(jié)果：1.HIR對大鼠腸系膜動脈血管環(huán)的作用：(1)用60mM KCl5min進(jìn)行預(yù)收縮兩次,將引起收縮差異小于20%的血管用于后續(xù)實驗。(2)用0.8μM NE去誘導(dǎo)血管收縮2min左右,加入25mg/L HIR可以使血管環(huán)舒張78.8±1.06%(n=5,P0.05)。(3)在0.8μM NE引起血管環(huán)預(yù)收縮,再此基礎(chǔ)上加入25mg/L HIR,在舒張明顯時加入5mMBKCa非特異性阻斷劑TEA,觀察到TEA對血管有收縮作用,說明HIR對大鼠腸系膜血管的舒張作用有K+通道參與。(4)當(dāng)0.8μM NE引起血管預(yù)收縮后,加入不同濃度的HIR,觀察血管環(huán)的舒縮變化,舒張明顯時,再加入200nM BKCa通道特異性阻斷劑IbTX,可引起血管收縮,其收縮百分比為7.96±1.06%,(n=3,P0.05),說明HIR對大鼠腸系膜血管的舒張作用有BKCa通道的參與。2.HIR對HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKCaα通道電流的作用：(1)HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKCaα通道的基本特征：(a) BKCaα通道的電導(dǎo)值：通過inside-out膜片鉗記錄,在140mM [K+]0/140mM [K+]i記錄條件下HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKα通道的電導(dǎo)值為236.73±3.27pS(n=5)。(b)在對稱性高鉀溶液時,觀察Ⅰ-Ⅴ曲線,曲線通過0點反轉(zhuǎn)電位為0mV。(c) BKCaα通道的電壓依賴性：在inside-out膜片鉗記錄下,膜電位從+10mV增加到+60mV時,隨著膜電位的增加,該通道的電流也逐漸增大。(d) BKCaα通道的鈣離子敏感性：在inside-out膜片鉗記錄下,隨著鈣離子濃度增加(0nM和111nM Ca2+),該電流明顯增大。(e)在outside-out膜片下,200nM IbTX幾乎可以完全阻斷該通道。(2)HIR對HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染的BKCaα通道電流的作用：HIR對BKCaα通道的藥物依賴性,在inside-out膜片鉗記錄下,膜電位為+50mV時,隨著HIR濃度的增加,BKCaα通道電流也隨之逐漸增大。當(dāng)HIR濃度從0mg/L分別增加到25、50、100、200mg/L時,BKCaα通道的開放概率分別從0.00683±0.0049增加到0.0159±0.0014(n=5,P=0.0380.05)、0.0228±0.0016(n=5,P=0.00610.05)、0.0469±0.0073(n=5,P=0.02760.05)、0.0856±0.0103(n=5,P=0.000290.01),說明HIR對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BKCaα通道電流的激活作用具有濃度依賴性。在此基礎(chǔ)上加入20mM EGTA(鈣離子螯合劑),該通道概率降低到0.0599±0.0070(n=5, P=0.00040.01), HIR激活BKCaα通道電流的作用仍存在。說明HIR對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系BKCaα通道電流的激活作用不依賴于鈣離子。BKCaα通道電流的幅度值(Amplitude, Amp)隨著藥物濃度的增加無明顯變化；BKCaα通道的平均開放時間(Open Time, To)隨著藥物濃度的增加有所增加,在200mg/LHIR時,與對照組相比較具有統(tǒng)計學(xué)差異；BKCaα通道的平均關(guān)閉時間(Close Time, Tc)隨著藥物濃度的增加有所降低,各組間無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論：1.HIR具有血管舒張。2.HIR的舒血管作用與HIR激活BKca通道相關(guān)。3.HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染BKCaα通道具有BKca通道基本特性。4.HIR對HEK293細(xì)胞上轉(zhuǎn)染BKCaα通道激活作用具有濃度依賴性,且不依賴鈣離子。
[Abstract]:Objective : To study the effect of high conductance calcium - activated potassium channels ( BK ca ) on vascular smooth muscle cells ( VSMRs ) . ( 2 ) A single - channel patch clamp experiment was carried out : The expression plasmid pcDNA3.1 - BK was transfected with the Lipofectamine 2000 transfection method , and the stable expression of monoclonal cell line was screened by 0.8 mg / ml G418 . ( 4 ) When 0.8渭M NE induced pre - contraction of blood vessels , the different concentrations of HIR were added to observe the relaxation and relaxation of vascular rings . ( 2 ) The effect of HIR on BK Ca 偽 channel current was increased gradually with increasing concentration of HIR . The effect of HIR on the channel current of stable transfected cell line BK Ca 偽 was decreased to 0.0159 鹵 0.0014 ( n = 5 , P = 0.0060.05 ) , 0.048 鹵 0.0073 ( n = 5 , P = 0.0000.070.05 ) , 0.0856 鹵 0.0103 ( n = 5 , P = 0.000290 . 01 ) .

【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：1476594