本文關(guān)鍵詞： 腦缺血再灌注 炎癥 炎癥因子 MaR1 MaR1 炎癥 NF-κB SIRT1 MaR1 血腦屏障 MMP9 MMP3　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分：Maresin 1 (MaRl)減輕小鼠腦缺血再灌注早期炎癥性損傷目的：探討不同劑量MaRl對(duì)小鼠腦缺血再灌注早期炎癥反應(yīng)的影響方法：采用線栓法(middle cerebral artery occlusion, MCAO)阻斷小鼠大腦中動(dòng)脈起始部,1小時(shí)候后拔出線栓,模擬腦缺血再灌注。75只健康雄性C57小鼠隨機(jī)分為5組(n=15)：(1)sham組：小鼠行麻醉和頸部血管分離操作與其他組相同,但不插入線栓,術(shù)后1小時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5ul; (2) MCAO組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5ul; (3)MCAO+0.1ng MaRl組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaRl0.1ng; (4)MCAO+lngMaRl組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaRl 1ng;(5)MCAO+10ng MaR1組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaR1 10ng.再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)取材,如無(wú)特殊說(shuō)明,取材部位為缺血側(cè)皮層,靠近梗死周邊部分。采用TTC染色、HE染色、FJ染色、TUNEL染色評(píng)估腦梗死和組織損傷,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)估功能學(xué)改變,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、膠質(zhì)細(xì)胞激活情況,分光光度計(jì)檢測(cè)腦組織中髓過氧化物酶含量。ELISA法檢測(cè)腦組織中細(xì)胞因子含量,Western Blotting技術(shù)檢測(cè)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：MCAO組小鼠腦缺血再灌注后,與sham組小鼠相比,再灌注24小時(shí)后缺血側(cè)有明顯的梗死,染色顯示有組織破壞、神經(jīng)細(xì)胞空泡變性伴隨炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),出現(xiàn)較多的細(xì)胞凋亡與壞死(P0.001),再灌注48小時(shí),72小時(shí)的神經(jīng)功能有明顯缺陷(P0.001),突觸相關(guān)蛋白表達(dá)顯著減少(P0.05)；炎癥因子水平、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和膠質(zhì)細(xì)胞激活明顯升高(P0.01)。MCAO術(shù)后給予MaRl 1ng可顯著減小梗死體積(P0.01),保護(hù)腦組織結(jié)構(gòu)與神經(jīng)元,減輕細(xì)胞死亡(P0.01)與神經(jīng)功能受損(P0.01)。降低炎癥因子水平(P0.01),抑制膠質(zhì)細(xì)胞激活和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)和髓過氧化物酶釋放。手術(shù)后給予0.1ngMaRl有輕微的保護(hù)作用但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,10ngMaRl組無(wú)保護(hù)作用,各項(xiàng)指標(biāo)與MCAO組幾乎無(wú)差異。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤顯示,數(shù)據(jù)的分析比較采用GraphPad Prism 5.0.軟件,使用單因素方差分析,兩組間比較采用Student-Newman-Keuls (SNK)法,P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論：MCAO手術(shù)可成功構(gòu)建腦缺血再灌注模型,各項(xiàng)監(jiān)測(cè)指標(biāo)顯示缺血側(cè)有明顯的損傷梗死和炎癥反應(yīng),側(cè)腦室注射MaR1最佳劑量為1ng時(shí),可顯著減輕小鼠腦缺血再灌注早期的炎癥反應(yīng),從而達(dá)減輕腦損傷。第二部分：Maresin1減輕小鼠腦缺血再灌注炎癥反應(yīng)的機(jī)制研究目的：研究MaRl作用于早期腦缺血再灌注炎癥反應(yīng)可能的機(jī)制或通路方法：線栓法建立小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型。實(shí)驗(yàn)分為AB兩部分,A部分30只健康雄性C57小鼠隨機(jī)分為5組(n=6):(1) sham組：小鼠行麻醉和頸部血管分離操作與其他組相同,但不插入線栓,術(shù)后1小時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5u1：(2)MCAO組：小鼠行MCA O手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5u1；(3)MCAO+0.1ng MaR1組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaR1 0.1ng; (4)MCAO+1ngMaRl組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaR1 1ng; (5) MCAO+10ngMaR1組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaRl10ng。再灌注24小時(shí)施行安樂死并取材,免疫熒光技術(shù)檢測(cè)核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB P65亞單位在胞質(zhì)胞核的分布情況,Western Blotting技術(shù)檢測(cè)NF-kB P65蛋白磷酸化乙�；絊IRT, Bax和Be12水平,以及P65蛋白在胞核胞質(zhì)的表達(dá)情況。B部分48只健康雄性C57小鼠隨機(jī)分為4組(n=12)：(1)MCAO組：手術(shù)前第5天,第3天,第1天分別腹腔注射一次1%DMSO溶劑對(duì)照液,一共注射三次。小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5u1;(2) MCAO+1ng MaRl組：手術(shù)前第5天,第3天,第1天分別腹腔注射一次1%DMSO溶劑對(duì)照液,一共注射三次。小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaRl 1ng; (3) MCAO+lng MaRl+EX527組：手術(shù)前第5天,第3天,第1天分別腹腔注射一次SIRT1抑制劑EX527(5mg/kg),一共注射三次。小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaRl lng;(4)MCAO+ EX527組：手術(shù)前第5天,第3天,第1天分別腹腔注射一次SIRT1抑制劑EX527 (5mg/kg),一共注射三次。小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5u1。再灌注24小時(shí)后取材,采用TTC染色,HE染色,FJ染色評(píng)估缺血側(cè)腦梗死體積和組織損傷,ELISA檢測(cè)腦組織炎癥因子TNF-α,IL-1β的含量,Western Blotting技術(shù)檢測(cè)SIRT1,乙酰化(acetylation, ac)-NF-κB, Bcl2,Bax蛋白的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)分析同第一部分結(jié)果：A部分缺血再灌注后,MCAO組小鼠Western Blotting與免疫熒光顯示,核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB P65入核明顯增多(P0.001),P65磷酸化增多(P0.001),同時(shí)乙�；皆龈�(P0.01)。SIRT1蛋白表達(dá)下降(P0.01)。促凋亡因子Bax蛋白水平顯著升高,抗凋亡因子Bc12下降(P0.01);MaRl明顯抑制MCAO引起的P65的核轉(zhuǎn)位(P0.001),降低p65磷酸化和乙�；�(P0.001),同時(shí)逆轉(zhuǎn)Bax與Be12的趨勢(shì),上調(diào)SIRT1的表達(dá)。B部分實(shí)驗(yàn),在MCAO造模前預(yù)注射SIRT1抑制劑EX527,再給予MaR1,與MCAO+MaRl組相比,SIRT1蛋白水平下降,乙�；疨65增多,促凋亡蛋白Bax增多抗凋亡蛋白Bc12減少；梗死體積有所增大,神經(jīng)損傷加重,但仍比MCAO造模組損傷輕,MCAO+EX527組與MCAO組無(wú)明顯差別。上述結(jié)果說(shuō)明SIRT1抑制劑使乙酰化NF-κB增多,可部分阻斷MaRl的保護(hù)作用。結(jié)論：MaR1對(duì)小鼠腦缺血再灌注早期炎癥損傷的保護(hù)作用可能部分是通過SIRTI-NF-κB通路實(shí)現(xiàn)的。第三部分:Maresin1對(duì)小鼠腦缺血再灌注血腦屏障的影響目的：研究MaRl對(duì)小鼠腦缺血再灌注血腦屏障損傷是否有保護(hù)作用。方法：MCAO造模方法同前面部分(n=15),實(shí)驗(yàn)分組：(1)sham組：小鼠行麻醉和頸部血管分離操作與其他組相同,但不插入線栓,術(shù)后1小時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5ul; (2) MCAO組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射生理鹽水2.5u1-(3) MCAO+MaRl組：小鼠行MCAO手術(shù),再灌注開始時(shí)側(cè)腦室注射MaRl 0.1ng,或lng,或10ng。再灌注24小時(shí)取材。檢測(cè)腦組織干濕重比,靜脈注射依文思藍(lán)評(píng)估血腦屏障通透性,明膠酶譜分析腦組織中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9的活性,免疫捕獲技術(shù)檢測(cè)MM3活性,Western Blotting技術(shù)分析zo-1,claudin5,MMP9在腦組織中蛋白表達(dá)水平,免疫熒光檢測(cè)血腦屏障組成蛋白zo-1,claudin5的表達(dá)趨勢(shì)與細(xì)胞定位。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。結(jié)果：缺血再灌注處理后,缺血側(cè)腦組織含水量明顯增加(P0.001),依文思藍(lán)滲出明顯,即血腦屏障通透性增加(P0.01),基質(zhì)金屬蛋白酶MMP9和MMP3活性明顯升高,血腦屏障組成蛋白zo-1,claudin5表達(dá)下降,MM9表達(dá)升高(P0.01),免疫熒光顯示趨勢(shì)大致與Western結(jié)果一致。MaRl最佳劑量為lng時(shí),可顯著降低腦缺血再灌注引起的腦水腫和依文思藍(lán)滲出(P0.05),抑制MM9和MM3的激活,降低MMP9的蛋白表達(dá)水平(P0.01),提高血腦屏障組成蛋白zo-1,claudin5的表達(dá)(P0.01)。結(jié)論：腦缺血再灌注損傷后,MaR1可保護(hù)血腦屏障組成蛋白,抑制基質(zhì)金屬蛋白酶活性,從而降低血腦屏障通透性,改善腦水腫達(dá)到腦保護(hù)作用。
[Abstract]:The first part : Maresin 1 ( MaR1 ) alleviated the early inflammatory injury of cerebral ischemia / reperfusion in mice . The effect of different doses of MaR1 on the early inflammatory reaction of cerebral ischemia - reperfusion in mice was studied . The experimental results showed that the model of cerebral ischemia - reperfusion in mice was significantly decreased ( P0.01 ) . A group of 48 healthy male C57 mice were injected with 1 % DMSO solvent control solution on the 5th , 3rd , and 1st days before operation . The expression level of SIRT1 was significantly increased ( P0.01 ) . The expression level of NF - 魏B P65 increased significantly ( P0.01 ) . The expression level of MMP - 9 , MMP - 9 and MMP - 9 in brain tissue were significantly increased ( P0.01 ) .

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.3

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