發(fā)布時(shí)間：2018-01-27 08:38

  本文關(guān)鍵詞： 高血壓 肥胖 脂肪傳入反射 交感神經(jīng)活動(dòng) 室旁核 Irisin 肥胖 代謝紊亂 脂肪組織 脂解效應(yīng) Irisin 肥胖 脂解效應(yīng) 激素敏感性脂肪酶 3T3L1脂肪細(xì)胞　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：肥胖以交感神經(jīng)過(guò)度激活、胰島素抵抗、糖和脂質(zhì)代謝紊亂為特征,可引起高血壓、糖尿病、代謝綜合征等多種心腦血管和代謝性疾病。本研究主要探討肥胖的交感神經(jīng)激活機(jī)制和代謝紊亂機(jī)制,并進(jìn)行了干預(yù)肥胖的實(shí)驗(yàn)性研究。實(shí)驗(yàn)在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖動(dòng)物模型和3T3L1脂肪細(xì)胞進(jìn)行,著重于探討：①脂肪傳入反射在肥胖性高血壓交感神經(jīng)激活中的作用及機(jī)制；②Irisin改善肥胖的代謝紊亂的作用與機(jī)制；③Irisin對(duì)脂解效應(yīng)的影響與分子機(jī)制。第一部分：脂肪傳入反射在肥胖性高血壓交感神經(jīng)激活中的作用與機(jī)制背景過(guò)度的交感神經(jīng)激活狀態(tài)在肥胖和肥胖性高血壓的發(fā)病機(jī)制以及并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵性作用。然而,肥胖性高血壓的交感神經(jīng)激活機(jī)制仍未闡明。我們近來(lái)發(fā)現(xiàn)在大鼠的白色脂肪組織(white adipose tissue, WAT)中注射辣椒素、緩激肽、腺苷或瘦素均能增強(qiáng)腎交感神經(jīng)活動(dòng)(renal sympathetic nerve activity, RSNA)和增加平均動(dòng)脈壓(mean arterial pressure, MAP)。我們將這種化學(xué)刺激WAT引起的交感神經(jīng)激活稱為脂肪傳入反射(adipose afferent reflex, AAR)。WAT去神經(jīng)支配或化學(xué)損毀下丘腦室旁核(paraventricular nucleus, PVN)均消除AAR, AAR是調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活動(dòng)和血壓的重要反射。神經(jīng)解剖學(xué)研究表明WAT中有感覺(jué)神經(jīng)末梢,并受交感傳出神經(jīng)支配。我們假設(shè)肥胖時(shí)增強(qiáng)的AAR可能在其交感神經(jīng)激活和高血壓的發(fā)生發(fā)展中起重要作用,本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖性高血壓大鼠模型,探討AAR對(duì)肥胖性高血壓交感神經(jīng)激活的作用及其調(diào)控機(jī)制。目的1.確定肥胖性高血壓大鼠的AAR是否增強(qiáng)。2.探討增強(qiáng)的AAR是否與肥胖性高血壓大鼠的交感神經(jīng)過(guò)度激活和血壓升高有關(guān)。方法實(shí)驗(yàn)采用雄性SD大鼠(體重300-350g)按照1：3比例隨機(jī)分為兩組。一組給予對(duì)照飲食(Ctrl組,脂肪提供12%的熱量,n=55),另一組給予高脂飲食(HFD組,脂肪提供42%的熱量,n=165)。飼養(yǎng)12周后,HFD組根據(jù)體重分為肥胖抵抗組(obesity-resistant, OR組)和肥胖傾向組(obesity-prone, OP組)。前者為大鼠體重小于或等于對(duì)照組最高體重的大鼠,后者為體重大于對(duì)照組最高體重的大鼠。OP組大鼠又根據(jù)尾動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure, SBP)再分為兩組,SBP150mmHg的大鼠屬于肥胖非高血壓組(obesity non-hypertensive, ON組),SBP≥150mmHg的大鼠屬于肥胖高血壓組(obesity hyertensive, OH組)。12周末在麻醉的狀態(tài)下進(jìn)行急性實(shí)驗(yàn),采用Powerlab生物信號(hào)采集系統(tǒng)記錄RSNA、MAP和心率(heart rate, HR).以腹股溝WAT (inguinal WAT, iWAT)應(yīng)用辣椒素引起的RSNA和MAP變化值作為評(píng)價(jià)AAR的指標(biāo)。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血漿去甲腎上腺素(norepinephrine, NE)、腎素和血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ,Ang Ⅱ)水平,免疫組織化學(xué)的方法研究大鼠PVN中c-fos陽(yáng)性神經(jīng)元的分布。用立體定位技術(shù)和微量注射泵進(jìn)行雙側(cè)PVN灌注。1.基礎(chǔ)交感神經(jīng)活動(dòng)測(cè)定：Ctrl、OR、ON和OH大鼠的血漿NE水平和靜脈快速注射六烴季銨引起MAP的最大變化值作為衡量基礎(chǔ)交感神經(jīng)活動(dòng)的兩個(gè)指標(biāo)。2.AAR水平測(cè)定：Ctrl、OR、ON和OH大鼠iWAT應(yīng)用辣椒素,觀察RSNA、MAP和HR的變化。3.OH大鼠在iWAT應(yīng)用辣椒素15 min后測(cè)定血漿NE、腎素和AngⅡ的水平。4. Ctrl、OR、ON和OH大鼠iWAT應(yīng)用resiniferatoxin (RTX)阻斷WAT感覺(jué)神經(jīng)末梢活動(dòng),觀察對(duì)基礎(chǔ)的RSNA、MAP、HR和AAR的效應(yīng)。5.OH大鼠rWAT和iWAT應(yīng)用RTX阻斷WAT感覺(jué)神經(jīng)末梢活動(dòng)后,測(cè)定5周內(nèi)大鼠清醒狀態(tài)下SBP的變化。6.WAT傳入神經(jīng)活動(dòng)(WAT afferent nerve activity, WANA)的測(cè)定：Ctrl、OR、ON和OH大鼠切斷WAT傳入神經(jīng)的中樞端后,在WAT傳入神經(jīng)的遠(yuǎn)端局部利多卡因,以應(yīng)用利多卡因后WANA降低的最大值代表基礎(chǔ)的WANA水平。7.OH大鼠腹膜后WAT (retroperitoneal WAT, rWAT)和iWAT注射瘦素拮抗劑LA,觀察RSNA、MAP和HR的變化。8. Ctrl、OR、ON和OH大鼠WAT應(yīng)用辣椒素后,觀察PVN的c-fos的陽(yáng)性神經(jīng)元表達(dá)。9. Ctrl、OR、ON和OH大鼠PVN灌注利多卡因抑制PVN神經(jīng)元活動(dòng)，，觀察對(duì)基礎(chǔ)的RSNA、MAP、HR和AAR的效應(yīng)。結(jié)果1.OH組基礎(chǔ)交感神經(jīng)活動(dòng)顯著高于其它三組,ON組高于Ctrl和OR組。2.Ctr1、OR、ON和OH大鼠在iWAT應(yīng)用辣椒素后RSNA和MAP均顯著升高。OH組AAR顯著高于其他三組,ON組顯著高于OR和Ctrl組。OR和Ctrl組無(wú)顯著差異。3.AAR能顯著升高OH組大鼠血漿腎素、Angll和NE水平。4. Ctrl、OR、ON和OH大鼠WAT應(yīng)用RTX后引起迅速和短暫的RSNA和MAP升高效應(yīng),20 min后,RTX引起ON和OH大鼠持續(xù)的RSNA和MAP降低效應(yīng),Ctrl和OR大鼠則無(wú)顯著變化。這種興奮和抑制效應(yīng)在OH組顯著高于其他三組,ON組高于Ctrl和OR組。5.OH大鼠在雙側(cè)iWAT和rWAT注射RTX后能引起SBP至少3周的顯著降低,4周后,SBP仍有降低趨勢(shì),但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。6.OH組大鼠基礎(chǔ)WANA顯著高于其他三組,ON組高于OR和Ctrl組。7.OH大鼠在雙側(cè)iWAT和rWAT注射瘦素拮抗劑后能降低RSNA和MAP,在5 min達(dá)到最低并持續(xù)至少15 min。8. Ctrl和OH大鼠WAT應(yīng)用辣椒素均能增加PVN中c-fos表達(dá)。OH大鼠在應(yīng)用辣椒素后c-fos表達(dá)顯著高于其他三組,ON組高于Ctrl和OR組。9.雙側(cè)PVN灌注利多卡因降低了OH和ON組的RSNA,并降低了OH組的MAP和HR。利多卡因?qū)SNA的效應(yīng)在OH組比ON組更顯著。PVN應(yīng)用利多卡因后四組的AAR均被阻斷。結(jié)論肥胖高血壓大鼠AAR顯著增強(qiáng)；增強(qiáng)的AAR,參與了肥胖性高血壓的交感神經(jīng)激活機(jī)制；PVN在肥胖時(shí)增強(qiáng)的AAR和交感神經(jīng)激活機(jī)制中起重要的作用。第二部分FNDC5/irisin抗肥胖小鼠代謝紊亂的作用與機(jī)制背景肥胖癥能引起一系列以能量代謝紊亂為特征的癥候群,包括胰島素抵抗、2型糖尿病、高脂血癥等。盡管對(duì)肥胖的發(fā)生機(jī)制研究的越來(lái)越深入,肥胖仍缺乏有效的治療策略。 Irisin發(fā)現(xiàn)于2012年,是可以促使小鼠的白色脂肪細(xì)胞發(fā)生棕色細(xì)胞樣改變的一種肌肉因子。運(yùn)動(dòng)可刺激過(guò)氧化物酶體增殖受體γ輔激活因子α(PCG-1α)的表達(dá),而PCG-1α可使III型纖連蛋白組件包含蛋白5(FNDC5)表達(dá)增多,FNDC5可蛋白水解并生成irisin,從而增加irisin水平。循環(huán)中irisin水平與人的上臂圍、體重指數(shù)(body mass index, BMI)-血糖水平、脂肪因子ghrelin和IGF-1水平均呈正相關(guān)；而與年齡、胰島素、膽固醇和脂聯(lián)素水平,以及肥胖人群的肝內(nèi)甘油三酯水平均呈負(fù)相關(guān)。代謝綜合征患者血中irisin水平顯著升高。然而,irisin水平持續(xù)升高對(duì)肥胖是否有改善作用仍然不清楚。本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠模型,探討FNDC5過(guò)表達(dá)和微量滲透泵皮下持續(xù)給予irisin對(duì)肥胖小鼠代謝紊亂的作用及機(jī)制。目的1.探討FNDC5過(guò)表達(dá)對(duì)肥胖小鼠能量消耗和代謝紊亂的影響。2.探討FNDC5過(guò)表達(dá)對(duì)肥胖小鼠脂解效應(yīng)的影響及機(jī)制。3.探討皮下持續(xù)給予irisin對(duì)肥胖小鼠代謝紊亂的影響。方法將6周齡雄性C57/BL6J小鼠隨機(jī)分為兩組,各24只,一組給予正常飲食(Ctrl組,脂肪提供12%的熱量),另一組給予高脂飲食(HFD組,脂肪提供60%的熱量)。6周后各組均隨機(jī)分為兩小組,分別尾靜脈注射表達(dá)綠色熒光蛋白(Vector)和FNDC5的慢病毒后(Ctrl-Vector, Ctrl-FNDC5, HFD-Vector, HFD-FNDC5四組,各12只),繼續(xù)飼養(yǎng)6周。另取12只6周齡小鼠給予高脂飲食,8周后隨機(jī)分為兩小組,分別植入皮下微量滲透泵給予saline和irisin (Saline和Irisin組,各6只),繼續(xù)飼養(yǎng)4周。急性實(shí)驗(yàn)于給予飲食12周末進(jìn)行。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定血清FNDC5、irisin、瘦素、胰島素、甘油三酯、膽固醇、游離脂肪酸、去甲腎上腺素、血管緊張素II水平。實(shí)時(shí)定量PCR方法和Western Blot方法分別鑒定FNDC5、解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)和激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase, HSL)的mRNA和蛋白水平。1.FNDC5過(guò)表達(dá)的效應(yīng)：(1) FNDC5過(guò)表達(dá)的鑒定：血清和組織中FNDC5和irisin的蛋白水平；(2)體重、總攝食量的變化；(3)小動(dòng)物CT測(cè)定小鼠體內(nèi)脂肪量;(4) PhenoMaster多通道代謝監(jiān)測(cè)系統(tǒng)測(cè)定小鼠24h能量代謝指標(biāo)：氧耗量、CO2生成量、產(chǎn)熱量和機(jī)體活動(dòng)量；(5)空腹血糖水平、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)、血壓；(6)血清瘦素、胰島素、去甲腎上腺素、血管緊張素II、膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸的水平；(7)SAT和VAT中脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化；(8)SAT和VAT中UCP1的mRNA和蛋白水平；(9)脂解效應(yīng)：以禁食4 h和24 h后血清中游離脂肪酸水平評(píng)價(jià);(10)SAT和VAT中HSL的mRNA水平以及HSL在絲氨酸563,565和660三個(gè)位點(diǎn)的磷酸化蛋白水平。2.肥胖小鼠皮下持續(xù)給予irisin的效應(yīng)：(1)體重、攝食量的變化；(2)空腹血糖水平、葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)；(3)血清膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸的水平。結(jié)果1.肥胖小鼠的骨骼肌中FNDC5和irisin蛋白表達(dá)均高于Ctrl小鼠,心臟中表達(dá)有升高趨勢(shì),而肝臟、SAT和VAT的表達(dá)無(wú)顯著差異；FNDC5過(guò)表達(dá)增加了血清、骨骼肌中FNDC5和irisin蛋白的水平。2.小鼠的FNDC5蛋白水平在骨骼肌中表達(dá)最高,心臟和肝臟中表達(dá)較高,在SAT和VAT中表達(dá)較低；irisin蛋白水平在骨骼肌中表達(dá)最高,心臟、SAT和VAT中表達(dá)較高,在肝臟中表達(dá)較低。3.FNDC5過(guò)表達(dá)對(duì)Ctrl和HFD小鼠的體重、攝食量和脂肪量均沒(méi)有顯著影響。4.FNDC5過(guò)表達(dá)增加了HFD小鼠的氧耗量、二氧化碳生成量和產(chǎn)熱量,但對(duì)機(jī)體活動(dòng)量無(wú)顯著影響。5.葡萄糖和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)顯示FNDC5過(guò)表達(dá)升高了HFD小鼠的胰島素敏感性。HFD小鼠的空腹血糖和動(dòng)脈收縮壓降低,但Ctrl小鼠無(wú)顯著變化。6. FNDC5過(guò)表達(dá)降低了HFD組血清去甲腎上腺素、胰島素、膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸水平,但對(duì)血管緊張素II和瘦素的水平無(wú)顯著影響。7.FNDC5過(guò)表達(dá)減小了HFD組SAT的脂肪細(xì)胞直徑,但對(duì)VAT的脂肪細(xì)胞大小無(wú)顯著影響。8.FNDC5過(guò)表達(dá)增加了Ctrl和HFD小鼠SAT中UCP1的mRNA和蛋白水平,對(duì)VAT中UCP1的mRNA和蛋白水平無(wú)顯著影響。9.HFD小鼠禁食4 h和24 h刺激下的脂解效應(yīng)均顯著增強(qiáng),Ctrl小鼠禁食24 h后脂解效應(yīng)增強(qiáng)。10. Ctrl和HFD小鼠SAT和VAT中HSL的mRNA水平以及在絲氨酸563和660位點(diǎn)的磷酸化HSL均顯著升高,而565位點(diǎn)磷酸化水平無(wú)明顯變化。11. Irisin組體重和攝食量與Saline組無(wú)顯著差異。12.葡萄糖和胰島素耐量實(shí)驗(yàn)顯示Irisin組胰島素敏感性顯著升高,同時(shí)空腹血糖水平降低。13. Irisin組血清中膽固醇、甘油三酯和游離脂肪酸水平顯著降低。結(jié)論FNDC5/irisin增加高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的能量消耗、改善高脂血癥、胰島素抵抗和高胰島素血癥等代謝紊亂；FNDC5/irisin增強(qiáng)脂解效應(yīng),可能與cAMP/PKA介導(dǎo)的HSL磷酸化增強(qiáng)有關(guān)。Irisin有望成為代謝性疾病的有效治療靶點(diǎn)。第三部分Irisin增強(qiáng)3T3L1脂肪細(xì)胞脂解效應(yīng)的作用與機(jī)制背景脂肪組織的脂解效應(yīng)是機(jī)體重要的生理過(guò)程,通過(guò)甘油三酯的動(dòng)員,釋放FFA和甘油到循環(huán)中,給機(jī)體提供能量。Irisin主要由III型纖連蛋白組件包含蛋白5 (FNDC5)蛋白水解生成,通過(guò)刺激白色脂肪細(xì)胞解偶聯(lián)蛋白1(uncoupling protein 1, UCP1)的表達(dá)和棕色細(xì)胞樣效應(yīng),對(duì)代謝產(chǎn)生有益作用。研究顯示FNDC5/irisin不僅是肌肉因子,也是脂肪因子。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)升高的irisin水平增加肥胖小鼠的能量消耗、抗代謝紊亂,同時(shí)增強(qiáng)脂解效應(yīng)。本研究在體外水平探討了irisin對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞脂解效應(yīng)的影響及其下游信號(hào)機(jī)制。目的1.探討irisin對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞脂解效應(yīng)的影響。2.探討irisin增強(qiáng)3T3L1脂肪細(xì)胞脂解效應(yīng)的信號(hào)機(jī)制。方法脂解效應(yīng)以3T3L1脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基中的甘油和脂肪酸水平評(píng)價(jià)。Real timePCR和Western Blot方法分別鑒定激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase,HSL)的mRNA水平和蛋白水平。1. Irisin促脂解作用的時(shí)間效應(yīng)：3T3L1細(xì)胞給予irisin 1000 ng分別處理30min、1 h、2 h和4 h后,觀察irisin在基礎(chǔ)狀態(tài)下和異丙腎上腺素(isoproterenol,ISO)刺激下脂解效應(yīng)的變化。2. Irisin促脂解作用的劑量效應(yīng)：3T3L1細(xì)胞分別給予0、10、100和1000ng的irisin處理1h后,觀察irisin在基礎(chǔ)狀態(tài)下和ISO刺激下脂解效應(yīng)的變化。3.3T3L1脂肪細(xì)胞給予腺苷酸環(huán)化酶抑制劑SQ22536或PKA抑制劑H-89預(yù)處理12 h后,給予irisin 1000 ng處理1 h,觀察SQ22536和H-89對(duì)irisin脂解效應(yīng)的影響。4.3T3L1脂肪細(xì)胞給予irisin 1000ng處理1 h后,測(cè)定細(xì)胞的cAMP水平和HSL的mRNA水平。5.3T3L1脂肪細(xì)胞給予irisin處理后,觀察基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞中HSL在絲氨酸563,565和660三個(gè)位點(diǎn)的磷酸化蛋白水平。結(jié)果1. Irisin對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂解效應(yīng)在1h達(dá)到最強(qiáng),4h后仍有增強(qiáng)趨勢(shì)；ISO刺激下的脂解效應(yīng)不隨irisin處理時(shí)間的改變而顯著變化。2. Irisin劑量性增加3T3L1脂肪細(xì)胞在基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂解效應(yīng)；而ISO刺激的脂解效應(yīng)并不隨irisin劑量的增大而增強(qiáng)。3.SQ22536和H-89預(yù)處理阻斷了irisin對(duì)3T3L1脂肪細(xì)胞的促脂解效應(yīng)。4. Irisin處理后,3T3L1脂肪細(xì)胞的cAMP水平、HSL的mRNA水平均顯著升局。5. Irisin處理后,3T3L1脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)HSL磷酸化蛋白在絲氨酸563和660位點(diǎn)表達(dá)均顯著升高,而565位點(diǎn)無(wú)顯著變化。結(jié)論Irisin增強(qiáng)3T3L1脂肪細(xì)胞基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂解效應(yīng),但對(duì)ISO刺激的脂解效應(yīng)無(wú)顯著影響。Irisin增強(qiáng)脂解效應(yīng)與cAMP/PKA介導(dǎo)的絲氨酸563和660位點(diǎn)的磷酸化HSL增強(qiáng)有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R589.2


本文編號(hào)：1468081