本文關(guān)鍵詞： 糖尿病 BMP-2 IGF-1 BMSCs 骨折愈合　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 糖尿病(Diabetes Mellitus, DM)是由于高血糖導(dǎo)致內(nèi)分泌代謝紊亂,造成包括骨骼、神經(jīng)、腎臟等多器官多系統(tǒng)損傷的全身性疾病。糖尿病患者胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏,胰島素樣生長(zhǎng)因子缺乏,礦物質(zhì)組織代謝紊亂。因其肌力下降,骨質(zhì)疏松,糖尿病患者易發(fā)生骨折,而且由于糖尿病患者骨質(zhì)減少,骨礦物質(zhì)減少等因素導(dǎo)致本身骨折延遲愈合或骨不連發(fā)生率很高。糖尿病患者骨折延遲愈合可造成神經(jīng)麻痹、肌肉萎縮、肢端壞疽、褥瘡、泌尿系感染等后果,甚至引發(fā)局部或全身性感染。糖尿病骨折治療效果欠佳且并發(fā)癥嚴(yán)重,因此如何治療糖尿病骨折日益受到重視。而近期研究表明,影響骨代謝的細(xì)胞因子在骨折愈合中起到關(guān)鍵性作用。骨折可能是最適合采用基因療法治療的疾病之一,因其只需一種或幾種相關(guān)生長(zhǎng)因子基因在骨折局部短暫表達(dá),即可有效的促進(jìn)骨折愈合。 骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)家族成員BMP-2在骨折愈合過(guò)程中所起的作用尤為顯著,是骨愈合的關(guān)鍵因子之一。BMP-2可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cells, BMSCs)向成骨細(xì)胞表型分化,促進(jìn)軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞成熟。BMP-2可特異性的將小鼠成肌細(xì)胞系細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞系細(xì)胞；目前認(rèn)為成骨細(xì)胞BMP-2的含量可反應(yīng)成骨細(xì)胞的骨形成能力。胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor-1,IGF-1)是另一促進(jìn)骨愈合的重要生物活性因子。IGF-1在骨折后期增殖軟骨細(xì)胞和成熟軟骨中的表達(dá),可延緩軟骨細(xì)胞向終末方向的分化,在維持軟骨細(xì)胞表型中發(fā)揮一定作用,推測(cè)IGF-1在骨質(zhì)疏松性骨折愈合過(guò)程中起重要調(diào)節(jié)作用。 但目前應(yīng)用生長(zhǎng)因子治療存在諸多問(wèn)題,如免疫排斥,提取困難,給患者經(jīng)濟(jì)加重負(fù)擔(dān),因而尚存在有待突破之處。而骨折延遲愈合選擇生物活性因子治療是未來(lái)研究的重要方向,從眾多因子中選擇最佳的生長(zhǎng)因子組合并選擇最優(yōu)的治療方式,可為有效、安全的提高治療效果提供臨床選擇方案。BMP-2、IGF-1在促進(jìn)骨折愈合過(guò)程種的作用得到了肯定,然而它們?cè)谔悄虿」钦塾线^(guò)程中扮演什么角色呢、又有什么樣的變化規(guī)律呢?我們擬通過(guò)糖尿病大鼠骨折動(dòng)物實(shí)驗(yàn),觀(guān)察骨折愈合過(guò)程中骨折局部的BMP-2、IGF-1含量變化以及骨折的愈合過(guò)程,從而推斷糖尿病骨折延遲愈合與二者的關(guān)系。BMP-、IGF-1是促進(jìn)BMSCs增殖分化的重要生長(zhǎng)因子,因此我們采用基因工程將BMP-2、IGF-1基因轉(zhuǎn)染BMSCs,并觀(guān)察高糖環(huán)境下轉(zhuǎn)染后的BMSCs種子細(xì)胞基因表達(dá)變化、增殖分化情況,進(jìn)一步探討能否用基因治療的方法改變糖尿病骨折延遲愈合,探討B(tài)MP-2、IGF-1基因轉(zhuǎn)導(dǎo)相互作用,為糖尿病骨折延遲愈合找到新的治療方法以及為預(yù)防其產(chǎn)生提供理論基礎(chǔ)和參考策略。 研究方法 本課題分三個(gè)步驟序貫研究,具體方案如下： 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：糖尿病大鼠與非糖尿病大鼠骨折模型的建立；不同時(shí)間點(diǎn)兩組大鼠骨折愈合情況觀(guān)察、血清中BMP-2、IGF-1測(cè)定,分析糖尿病骨折延遲愈合可能的影響因素。 (1)Wistar雄性大鼠,隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,實(shí)驗(yàn)組腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素,按標(biāo)準(zhǔn)糖尿病大鼠模型指標(biāo)選取糖尿病大鼠。所有大鼠水合氯醛腹腔麻醉下切開(kāi)顯露左側(cè)脛骨,線(xiàn)鋸鋸斷脛骨,關(guān)閉切口,然后進(jìn)行復(fù)位夾板外固定。 (2)術(shù)后第1、2、3、4、6周分別門(mén)靜脈靜脈取血,高速離心后取血清,放置于-20℃冰箱內(nèi)保存。處死大鼠后,檢測(cè)骨密度和最大橫截面積,切開(kāi)取骨折端骨痂甲醛固定、脫鈣、酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,切片、HE染色,分析骨折愈合情況。 (3)Elisa法檢測(cè)血清BMP-2、IGF-1表達(dá)。 (4)所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析比較,得出相應(yīng)結(jié)論。 2.細(xì)胞培養(yǎng)：利用基因工程將BMP-2、IGF-1目的基因轉(zhuǎn)染BMSCs,在高糖環(huán)境下觀(guān)察BMSCs增殖分化情況。 (1)構(gòu)建BMP-2、IGF-1質(zhì)粒載體。 (2) BMSCs的分離純化：抽取健康Wistar大鼠股骨、脛骨骨髓,采取密度離心法和貼壁篩選法分離純化BMSCs。 (3)基因轉(zhuǎn)染：取BMSCs,轉(zhuǎn)染BMP-2、IGF-1目的基因,分為對(duì)照組(不含目的基因)、BMP-2組、IGF-1組、BMP-2及IGF-1組。 (4)各組分別在高糖DMEM培養(yǎng)基和正常糖含量培養(yǎng)基中,37度、5%C02、濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。 (5)分別定量RT-PCR檢測(cè)培養(yǎng)5天,10天BMSCs的BMP-2,IGF-1mRNA表達(dá)。 (6) Western-blot法檢測(cè)各組轉(zhuǎn)染后BMP-2、IGF-1蛋白表達(dá)。 (7)所得數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析比較,得出相應(yīng)結(jié)論。 3.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：重新制備糖尿病大鼠骨折模型將含有BMP-2、IGF-1目的基因的種子細(xì)胞BMSCs注射到骨折局部,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)骨折局部BMP-2、IGF-1表達(dá)情況,觀(guān)察骨折愈合情況。 (1)構(gòu)建攜帶BMP-2、IGF-1目的基因的種子細(xì)胞BMSCs。 (2)糖尿病大鼠骨折模型制備同上。 (3)將BMP-2和IGF-1共轉(zhuǎn)染的BMSCs局部注射糖尿病大鼠骨折局部。 (4)術(shù)后第1、2、3、4、6周,處死大鼠后,檢測(cè)觀(guān)察骨密度和最大橫截面積,切開(kāi)取骨折端骨痂甲醛固定、脫鈣、酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋,切片、HE染色,分析骨折愈合情況。 (5) Elisa法檢測(cè)血清BMP-2、IGF-1表達(dá)。 (6)ALP活性定量測(cè)定,以判斷成骨細(xì)胞變化。 (7)分析比較數(shù)據(jù),得出結(jié)論。 研究結(jié)果 1糖尿病大鼠經(jīng)鏈脲佐菌素(Streptozotocin, STZ)誘導(dǎo)后血糖值均高于16.7mmol/L,尿糖出現(xiàn)+++以上,出現(xiàn)多飲、多食,活動(dòng)減少,反應(yīng)遲鈍,皮毛松散,且癥狀隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重,骨折1周后精神狀況有所緩解及活動(dòng)增加,證實(shí)成功制備糖尿病大鼠模型。 2糖尿病大鼠組骨痂局部骨密度雖有所增加,但與正常對(duì)照組相比,增加幅度明顯低,差異具備顯著性(P0.05),且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),差異顯著性進(jìn)一步增加。 3糖尿病大鼠組骨痂最大橫截面積明顯大于正常對(duì)照組,差異具備顯著性(P0.05),且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),差異顯著性進(jìn)一步增加。 4組織學(xué)結(jié)果顯示術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)糖尿病組較對(duì)照組大鼠骨折處愈合過(guò)程中骨痂軟骨細(xì)胞肥大并且軟骨細(xì)胞等成熟延遲,成骨細(xì)胞較少。 5術(shù)后第1-3周BMP-2和IGF-1趨勢(shì)相似,濃度逐步上升,且和對(duì)照組之比較具備顯著差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；隨后二者濃度下降,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。 6高糖環(huán)境下,利用BMP-2和IGF-1分別轉(zhuǎn)染和共轉(zhuǎn)染BMSCs, BMP-2和IGF-1共轉(zhuǎn)染組BMP-2和IGF-1的表達(dá)增高更加明顯,較各單獨(dú)轉(zhuǎn)染組增高差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 7利用BMP-2和IGF-1共轉(zhuǎn)染BMSCs基因局部治療,骨密度以及骨痂最大橫截面積得以顯著改善(P0.05)。組織學(xué)結(jié)果顯示,治療后,可有效增加成熟軟骨細(xì)胞分化和成骨細(xì)胞增殖,顯著促進(jìn)骨折愈合。 8基因治療后,BMP-2和IGF-1的表達(dá)水平與糖尿病組比較,有顯著提高,差異具備統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。血中ALP水平得以明顯改變,說(shuō)明BMP-2和IGF-1的BMSCs的基因治療有利于骨折的愈合。 結(jié)論 1糖尿病可導(dǎo)致骨密度下降,嚴(yán)重影響骨折后骨折部位骨痂的形成。 2糖尿病大鼠骨折愈合過(guò)程中早期血清中BMP-2, IGF-1的減少,是引起骨折愈合差的因素之一。 3在高糖環(huán)境下,BMP-2, IGF-1共轉(zhuǎn)染BMSCs可正反饋促進(jìn)BMP-2, IGF-1的表達(dá)。 4BMP-2, IGF-1共轉(zhuǎn)染BMSCs基因治療后可明顯改善糖尿病大鼠骨折愈合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2

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本文編號(hào)：1467889