本文關(guān)鍵詞： TLR8 CL075 Poly dT 樹突狀細(xì)胞 Lewis肺癌 宮頸癌 Bcl-2 VEGF　出處：《江蘇大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的： (1)利用來源于C57BL/6小鼠的樹突狀細(xì)胞系DC2.4,探討聯(lián)合應(yīng)用人TLR8激動(dòng)劑CL075和TLR7/8調(diào)節(jié)劑Poly dT后,小鼠TLR8能否被激活以及TLR8激活以后對(duì)TLR8以及相關(guān)細(xì)胞因子如IL-10、IL-12和TNF-a表達(dá)的影響； (2)建立小鼠腫瘤模型(Lewis肺癌模型),進(jìn)一步探討TLR8激活對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響及其抗腫瘤免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制； (3)利用臨床腫瘤標(biāo)本(人宮頸癌組織)以及相關(guān)細(xì)胞系(人宮頸癌Hela細(xì)胞),觀察TLR8在人體癌組織的表達(dá)以及TLR8激活以后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和生存的影響,以便為以TLR8為靶點(diǎn)的腫瘤免疫治療提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。方法： (1)在體外實(shí)驗(yàn)中,DC2.4細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng),光學(xué)顯微鏡下觀察其經(jīng)PBS、CL075、Poly dT以及CL075與Poly dT聯(lián)合用藥刺激后的形態(tài)學(xué)變化；RT-PCR或qPT-PCR、免疫熒光法以及Western-blot檢測(cè)TLR8在DC2.4的表達(dá)與分布；qPT-PCR、ELISA法檢測(cè)DC2.4經(jīng)上述藥物刺激以后相關(guān)細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和IL-10的表達(dá)；MTT比色法檢測(cè)TLR8激動(dòng)劑激活受體后對(duì)DC2.4抗原提呈功能的影響；qRT-PCR與Western-blot檢測(cè)經(jīng)藥物刺激后對(duì)TLR8受體表達(dá)的影響。 (2)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,取純系C57BL/6小鼠,22-24克,雄性,隨機(jī)分成三組,每組10只。小鼠右側(cè)腹壁消毒后,皮下注射Lewis肺癌細(xì)胞3.0×106個(gè)細(xì)胞/只,建立Lewis肺癌小鼠模型。Lewis細(xì)胞接種于小鼠當(dāng)天即開始給藥,PBS、CL075和Poly dT均經(jīng)腹腔注射給藥。CL0750.2μg+Poly dT5μg(低劑量組)每天給藥一次,PBS組、CL0752μg+Poly dT50μg(高劑量組)每?jī)商旖o藥一次。接種Lewis肺癌細(xì)胞第1天后,隔天用電子天平測(cè)量小鼠體重一次,7天后,用脫毛劑對(duì)各實(shí)驗(yàn)組小鼠進(jìn)行脫毛,觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。肉眼觀察并按摸皮下結(jié)節(jié),用游標(biāo)卡尺隔天測(cè)量1次腫瘤結(jié)節(jié)的長(zhǎng)徑a及短徑b,單位mm,根據(jù)公式V=1/2×axb2估算腫瘤體積。給藥后第二十一天,在麻醉狀態(tài)下斷頸處死小鼠,取出腫瘤組織,用電子天平稱重,計(jì)算每組平均瘤重,qRT-PCR檢測(cè)小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中TLR8、IL-12、TNF-α、IL-10、TGF-βFoxp3的表達(dá),FCM檢測(cè)小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中CDllc+細(xì)胞TLR8的表達(dá),FCM檢測(cè)小鼠脾臟及引流淋巴結(jié)中CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞、CD3+CD8+IFNγ+T細(xì)胞以及CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例。 (3)臨床標(biāo)本分析采用病人宮頸癌組織,并結(jié)合宮頸癌細(xì)胞系進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證工作。人宮頸癌細(xì)胞系Hela細(xì)胞用含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用RT-PCR/qRT-PCR、免疫熒光法檢測(cè)Hela細(xì)胞TLR8的表達(dá)與分布,流式細(xì)胞術(shù)、MTT比色法檢測(cè)TLR8激動(dòng)劑CL075對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響,qRT-PCR檢測(cè)COX-2.Bcl-2VEGF在經(jīng)CL075刺激的人宮頸癌細(xì)胞株中的表達(dá)。取人宮頸癌組織及健康對(duì)照組樣本,qRT-PCR檢鋇TLR7、TLR8與Bcl-2或VEGF的表達(dá)并分析其相關(guān)性,最后綜合分析TLR8在人宮頸癌細(xì)胞的表達(dá)及TLR8激動(dòng)劑對(duì)腫瘤增殖和存活的影響。結(jié)果: (1)光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),DC2.4細(xì)胞呈梭形、星狀和多角形,與成熟的樹突狀細(xì)胞相比,樹狀突起不長(zhǎng),個(gè)體較小,細(xì)胞透亮,細(xì)胞核清晰。分別用PBS、CL075、Poly dT以及CL075+Poly dT刺激24h后,繼續(xù)在光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)：經(jīng)CL075+Poly dT聯(lián)合用藥刺激的DC2.4細(xì)胞樹突增多且伸長(zhǎng),而未刺激、單用CL075或Poly dT刺激的DC2.4細(xì)胞樹突較短且少。RT-PCR/qPT-PCR.免疫熒光法以及Western-blot分別從mRNA水平和蛋白水平證實(shí)DC2.4細(xì)胞表達(dá)TLR8,而且TLR8主要分布于細(xì)胞漿內(nèi)。通過qRT-PCR口ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組相比,無論是mRNA水平還是蛋白水平,CL075+Poly dT聯(lián)合用藥組細(xì)胞分泌TNF-α和IL-12的水平均顯著增加(*p0.05),而IL-10的分泌水平顯著降低(*p0.05).盡管CL075處理組細(xì)胞TNF-α mRNA、TNF-α蛋白和IL-12mRNA水平也略有增加,但與對(duì)照組相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而Poly dT處理組DC2.4細(xì)胞TNF-α、IL-12和IL-10的mRNA和蛋白表達(dá)量均無變化�；旌狭馨图�(xì)胞反應(yīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比,經(jīng)CL075+Poly dT刺激72h后的DC2.4可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖(與對(duì)照組相比,**p0.01),且T細(xì)胞與DC的比例為5：1時(shí)刺激作用更明顯。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),CL075+Poly dT聯(lián)合處理組的DC2.4細(xì)胞中TLR8mRNA和TLR8蛋白的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組(*p0.05),CL075或Poly dT單獨(dú)處理組DC2.4細(xì)胞TLR8的表達(dá)量與陰性對(duì)照組相比無明顯變化。 (2)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),腹腔注射CL075與Poly dT有效抑制了腫瘤的生長(zhǎng)。CL075+Poly dT高劑量組小鼠的腫瘤體積與腫瘤重量明顯小于PBS對(duì)照組(*P0.05,n=10)。與PBS組相比,CL0752μg+Ply dT50μg(高劑量)組、CL0750.2μg+Poly dT5μg(低劑量)組小鼠體重?zé)o明顯差別。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),高劑量CL075+Poly dT可以顯著增加荷瘤小鼠脾臟和引流淋巴結(jié)IL-12mRNA的表達(dá),引流淋巴結(jié)中TNF-α mRNA的表達(dá)也顯著增加,而抑制性細(xì)胞因子IL-10.TGF-βFoxp3的mRNA在脾臟和引流淋巴結(jié)中的表達(dá)量則明顯降低(與對(duì)照組相比,*P0.05或**P0.01,n=4)。流式細(xì)胞術(shù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),高劑量CL075+Poly dT可以促進(jìn)脾臟和引流淋巴結(jié)中CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞和CD3+CD8+IFNγ+T細(xì)胞的增殖,而明顯抑制CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的增殖(與對(duì)照組相比,*P0.05或**P0.01,n=6),證明CL075與PolydT聯(lián)合應(yīng)用一方面通過刺激荷瘤小鼠分泌IL-12、TNF-α等細(xì)胞因子,誘導(dǎo)Thl型應(yīng)答和CD8+細(xì)胞毒作用,從而增強(qiáng)小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答；另一方面,CL075與Poly dT合用,可通過減少荷瘤小鼠體內(nèi)抑制性細(xì)胞因子如IL-10、TGF-β和Foxp3的表達(dá),和抑制CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞的增殖而負(fù)向調(diào)控腫瘤免疫耐受,從而有效增強(qiáng)了荷瘤小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答,延緩了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。本研究同時(shí)還發(fā)現(xiàn),與高劑量CL075+Poly dT目比,低劑量CL075+PolydT抑制腫瘤生長(zhǎng)和增強(qiáng)抗腫瘤免疫的作用雖然不如高劑量明顯,但仍有一定的作用。而且,低劑量CL075+Poly dT可以明顯誘導(dǎo)脾臟和引流淋巴結(jié)中CDllc+細(xì)胞TLR8的表達(dá),這和我們?cè)隗w外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的CL075與Poly dT合用誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞TLR8表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。 (3)我們采用RT-PCR和qRT-PCR檢測(cè)了包括Hela細(xì)胞在內(nèi)的十三種人類腫瘤細(xì)胞系,包括95D.HepG2.NICH446.U266.SGC.HCT-8. BGC.SW620.A549.HT1080.SKOV.3和U937等細(xì)胞TLR8的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),SKOV-3.U937和Hela表達(dá)高水平的TLR8mRNA,胃癌SGC,HCT8,BGC,SW620,A549和HT1080表達(dá)低水平TLR8;而在95D.HepG2.NICH446或U266細(xì)胞沒有檢測(cè)到TLR8mRNA.TLR8mRNA在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平顯著高于其他細(xì)胞系,免疫熒光染色表明Hela細(xì)胞表達(dá)TLR8蛋白,而且TLR8分布于細(xì)胞漿內(nèi)。用不同濃度的TLR8激動(dòng)劑CL075處理HeLa細(xì)胞48小時(shí)后,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)G2/M+S期細(xì)胞的百分比增加,提示細(xì)胞增殖增加,這一結(jié)果被MTT法進(jìn)一步證實(shí)。不同于順鉑,CL075沒有誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡。CL075(1μg/ml)處理24小時(shí)后,Hela細(xì)胞中COX-2, BCL-2和VEGF mRNA水平顯著增加并在48小時(shí)達(dá)到峰值。定量RT-PCR結(jié)果表明,與沒有癌癥患者的宮頸組織相比,宮頸癌患者組織樣本中TLR7和TLR8的]mRNA水平增高。與此相反,TLR9在癌癥患者和對(duì)照組組織樣本中的表達(dá)沒有明顯差異,此外,Bcl-2和VEGF在宮頸癌患者的癌組織中的表達(dá)水平也顯著增加。采用Spearman分析,我們發(fā)現(xiàn)宮頸癌樣本中TLR8口Bcl-2或VEGF的表達(dá)水平之間存在正相關(guān),而TLR7和Bcl-2或、/EGF mRNA表達(dá)水平的變化并無明顯相關(guān)性。結(jié)論： (1)人TLR8激動(dòng)劑CL075與TLR7/8調(diào)節(jié)劑Poly dT聯(lián)合應(yīng)用可以有效激活小鼠TLR8,而且小鼠TLR8活化以后產(chǎn)生與人TLR8相似的效應(yīng),如誘導(dǎo)髓系樹突狀細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12,減少IL-10的分泌,有利于誘導(dǎo)Thl型免疫,增強(qiáng)DC的抗原提呈功能。因此,可以將[CL075+Poly dT]作為工具藥,以小鼠為模型體內(nèi)外研究TLR8的功能。 (2)TLR8可以作為腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)。在體外,TLR8激動(dòng)劑誘導(dǎo)DC2.4分泌TNF-α和IL-12,增強(qiáng)DC2.4的抗原提呈功能,而且這些作用可能和DC2.4細(xì)胞TLR8的上調(diào)有關(guān)；在體內(nèi),TLR8激動(dòng)劑促進(jìn)荷瘤小鼠Th1型免疫應(yīng)答炎性細(xì)胞因子(TNF-α和IL-12)的產(chǎn)生、減少包括IL-10, TGF-β和Foxp3的免疫抑制因子的分泌,刺激CD3+CD8-IFN-γ+T細(xì)胞和CD3+CD8+IFN-γ+T細(xì)胞的增殖,抑制CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的增殖,從而增強(qiáng)Lewis肺癌模型小鼠的抗腫瘤免疫應(yīng)答,延緩腫瘤的發(fā)展進(jìn)程,并且小劑量CL075+PolydT上調(diào)樹突狀細(xì)胞TLR8的表達(dá)以增強(qiáng)其對(duì)激動(dòng)劑的反應(yīng)。這些結(jié)果表明,TLR8的活化以及DC等免疫細(xì)胞TLR8的上調(diào)有利于增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。 (3)然而,不同的腫瘤以及發(fā)生于不同個(gè)體的同一種腫瘤具有明顯的非均一性,因此TLR8及其激動(dòng)劑的抗腫瘤作用需要全面評(píng)估,這在腫瘤的個(gè)體化治療中具有十分重要的意義。人宮頸癌組織及宮頸癌細(xì)胞系高表達(dá)TLR8,這些腫瘤細(xì)胞也利用TLR8信號(hào)來創(chuàng)造有利于生長(zhǎng)和生存的條件,如上調(diào)Bcl-2和VEGF表達(dá)。這表明TLR8信號(hào)在腫瘤治療中可能是一把雙刃劍。TLR8及其激動(dòng)劑在不同類型的腫瘤中可能發(fā)揮不同的作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R730.51

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1458268