本文關(guān)鍵詞： 解耦連蛋白2 腹主動(dòng)脈瘤 抗氧化 抗細(xì)胞凋亡　出處：《西南醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:目前研究提示腹主動(dòng)脈瘤(AAA)形成機(jī)制包括炎癥反應(yīng)、基質(zhì)降解和重塑都與活性氧(ROS)有一定程度的關(guān)系,線粒體解偶聯(lián)蛋白2(UCP-2)被認(rèn)為是抗氧化劑,位于線粒體內(nèi)膜的陰離子載體,在多個(gè)組織都有表達(dá),通過維持活性氧的平衡防止氧化損傷;UCP-2在不同的細(xì)胞已經(jīng)被確定為凋亡抑制基因,主動(dòng)脈瘤及夾層已被證實(shí)存在血管平滑肌細(xì)胞凋亡;因此,我們認(rèn)為UCP-2是一個(gè)關(guān)鍵因素,通過抗氧化和抗凋亡抑制AAA的形成。為了確定這一假設(shè),通過UCP-2和載脂蛋白E(Apo E)雙基因敲除小鼠測定UCP-2在AAA的病理作用。方法:1、UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)雙敲小鼠由UCP-2~(-/-)與Apo E~(-/-)小鼠雜交產(chǎn)生,PCR法檢測基因敲除小鼠的基因分型,DNA樣本取自小鼠尾部;2、實(shí)驗(yàn)分組:野生小鼠(WT)、單基因敲除小鼠(Apo E~(-/-))、雙基因敲除小鼠(UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-));3、腹主動(dòng)脈瘤造模:選擇8周齡雄性小鼠吸入異氟醚麻醉后,將含有血管緊張素II(1000ng/kg/min;Sigma)的微型滲透泵(Alzet,2004)置于小鼠背部皮膚下持續(xù)4周;4、采用q RT PCR和蛋白免疫印跡試驗(yàn)的方法檢測WT、Apo E~(-/-)、Apo E~(-/-)+Ang-Ⅱ各組腹主動(dòng)脈UCP2 mRNA和蛋白的表達(dá)情況;5、通過HE、VVG、-SMA染色的方法檢測小鼠造模4周后腹主動(dòng)脈外膜增厚、彈性纖維、平滑肌細(xì)胞情況;6、采用蛋白免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting)檢測各組MMP2、MMP9炎癥因子在腹主動(dòng)脈瘤的表達(dá);7、通過超氧化物陰離子熒光探針(DHE)染色評估活性氧(ROS)水平,用熒光顯微鏡490 nm和590 nm發(fā)射的激發(fā)波長觀察�；钚匝鮎OS的熒光強(qiáng)度用Image J圖像處理軟件進(jìn)行定量;通過NADPH氧化酶活性、丙二醛(MDA)濃度和超氧化物歧化酶(SOD)活性測定氧化應(yīng)激水平,組織勻漿用二亞苯基碘(DPI)檢測NADPH氧化酶活性,硫代巴比妥酸(TBA)檢測丙二醛,硝基四氮唑藍(lán)(NBT)檢測SOD活性;8、TUNEL法檢測腹主動(dòng)脈瘤細(xì)胞凋亡情況,在細(xì)胞凋亡過程中,會(huì)激活一些DNA酶使基因組DNA斷裂,暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(Td T)的催化下結(jié)合綠色熒光探針的熒光素(FITC)標(biāo)記的d UTP,通過熒光顯微鏡檢測到;半胱天冬酶-3(caspase 3)是參與執(zhí)行細(xì)胞凋亡的一個(gè)關(guān)鍵酶,在凋亡的早期階段被激活,裂解相應(yīng)的胞核底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。通過caspase 3蛋白免疫印跡檢測表達(dá);結(jié)果:1、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示UCP-2 mRNA及蛋白的表達(dá)在Ang-Ⅱ誘導(dǎo)的Apo E~(-/-)造模小鼠均明顯增高,表明腹主動(dòng)脈瘤UCP-2的表達(dá)變化發(fā)生在翻譯和轉(zhuǎn)錄水平;2、通過血管緊張素Ⅱ處理后,UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)雙敲小鼠腹主動(dòng)脈瘤的發(fā)生率(83.9%,26 of 31)明顯高于UCP-2+/+Apo E~(-/-)小鼠(55%,11 of 20),并且UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)小鼠主動(dòng)脈明顯擴(kuò)張,組織學(xué)研究顯示腹主動(dòng)脈外膜肥厚,彈性纖維斷裂和平滑肌細(xì)胞減少;3、通過熒光染料DHE染色檢測,UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)雙敲小鼠主動(dòng)脈活性氧增加,UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)雙敲小鼠NADPH氧化酶活性和MDA水平明顯高于UCP-2+/+Apo E~(-/-)或野生型小鼠,此外,UCP-2+/+Apo E~(-/-)小鼠與野生型小鼠相比SOD活性增加,而UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)雙敲小鼠SOD活性增加減少,表明UCP-2對血管緊張素-Ⅱ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和腹主動(dòng)脈瘤形成起保護(hù)作用。研究結(jié)果還表明UCP-2基因敲除上調(diào)主動(dòng)脈瘤MMP2和MMP9的表達(dá);4、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)小鼠中Ang-Ⅱ誘導(dǎo)VSMCs凋亡增加,并且在UCP-2~(-/-)Apo E~(-/-)小鼠血管組織caspase-3蛋白表達(dá)明顯增加;結(jié)論:研究表明,在血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈瘤造模小鼠中,UCP-2mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯增高,缺乏UCP-2通過增加活性氧水平與血管平滑肌細(xì)胞凋亡,增加腹主動(dòng)脈瘤易感性及嚴(yán)重程度,表明UCP-2可以作為被抗氧化劑和抗凋亡因素預(yù)防腹主動(dòng)脈瘤。
[Abstract]:Objective: the present study suggests that abdominal aortic aneurysm (AAA) formation mechanism including inflammation, matrix degradation and remodeling with reactive oxygen species (ROS) have a certain degree of mitochondrial uncoupling protein 2 (UCP-2) is considered as antioxidants, located in the inner mitochondrial membrane anion carrier, in a number of organizations have expressed, prevent oxidation damage by maintaining active oxygen balance; UCP-2 has been identified in different cell apoptosis suppressor gene, aortic aneurysm and dissection has been confirmed the presence of apoptosis of vascular smooth muscle cells; therefore, we think that UCP-2 is a key factor, through the formation of antioxidant and anti apoptosis of AAA. In order to confirm this hypothesis, and by UCP-2 apolipoprotein E (Apo E) double knockout mice were UCP-2 in the pathological role of AAA. Methods: 1, UCP-2~ (- / -) Apo (- / -) E~ double knockout mice by UCP-2~ and Apo (- / -) E~ (- / -) mice were generated by PCR assay. 嫻嬪熀鍥犳暡闄ゅ皬榧犵殑鍩哄洜鍒嗗瀷,DNA鏍鋒湰鍙栬嚜灝忛紶灝鵑儴;2,瀹為獙鍒嗙粍:閲庣敓灝忛紶(WT),鍗曞熀鍥犳暡闄ゅ皬榧，

本文編號：1450071