本文關鍵詞：N-Shc、Egr-4和KCC2在局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良Ⅱa型相關難治性癲癇灶未成熟神經(jīng)元中的表達及相關機制研究　出處：《福建醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：第一部分Egr-4、N-Shc和KCC2在局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良IIa型相關難治性癲癇中的表達及意義 目的：探討局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良IIa型（FCDIIa）相關難治性癲癇（IE)致癇灶中即刻早期反應基因-4(Egr-4)、銜接蛋白Shc（N-Shc）和K+-CL-轉運體（KCC2）的表達情況及其意義。 方法：1、用免疫組化超敏二步法檢測10例FCDIIa相關IE組癲癇灶（實驗組）與10例正常腦組織（對照組）中N-Shc和KCC2蛋白的表達。2、FCDIIa相關IE組癲癇灶和對照組正常腦組織各6例用Westernblotting法檢測N-Shc蛋白的表達量。3、應用Real-time qPCR法檢測10例FCDIIa相關IE組癲癇灶（實驗組）和10例正常腦組織（對照組）N-Shc、Egr-4和KCC2的編碼基因轉錄水平。 結果：1、免疫組化：對照組中神經(jīng)元N-Shc和KCC2呈弱陽性表達，而實驗組中形態(tài)異常神經(jīng)元（DNs）呈強陽性明顯。 2、Western blotting：實驗組中的N-Shc的表達量明顯高于對照組。 3、Real-time qPCR:與對照組比較，實驗組中N-Shc、Egr-4和KCC2兩種蛋白的編碼基因轉錄水平均升高。 結論：1、DNs中N-Shc和KCC2表達異常增高可能與FCDIIa相關IE的產(chǎn)生相關。 2、在FCDIIa相關難治性癲癇中BDNF可能通過激活BDNF-SHC-KCC2和BDNF-EGR-KCC2兩條信號通路導致DNs中KCC2的表達增高，引起神經(jīng)元中氯離子濃度下降，最終介導GABA的抑制性效應發(fā)揮抑制癲癇的作用。 第二部分N-Shc和KCC2在胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)中的表達及意義 目的：探討經(jīng)BDNF干預后銜接蛋白SHC（N-Shc）和K+-CL-轉運體（KCC2）在胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中表達的情況及其意義。 方法：1、取懷孕18天（E18）的SD大鼠，采用水合氯醛腹腔注射麻醉，酒精消毒后剖宮取出胎鼠，并在解剖顯微鏡下去除軟腦膜，運用濃度為0.125%的胰蛋白酶消化法加機械吹打法分離細胞并在無血清培養(yǎng)基進行細胞培養(yǎng)；體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元分為A組：未成熟組Ⅰ；B組：未成熟組Ⅱ；C組：成熟組； A1組：BDNF干預組未成熟組Ⅰ；B1組：BDNF干預未成熟組Ⅱ；C1組：BDNF干預成熟組。A組：培養(yǎng)第1天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)無血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時；B組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)無血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時；C組：培養(yǎng)第7天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)無血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時；A1組：培養(yǎng)第1天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元加入BDNF（50ng/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)12小時；B1組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元加入BDNF（50ng/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)12小時；C1組：培養(yǎng)第7天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元加入BDNF（50ng/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)12小時；采用細胞免疫學法檢測大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的特異性烯醇化酶(NSE)的表達，在顯微鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元的生長情況和純度。應用RT-PCR法檢測各組胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的N-Shc和KCC2的編碼基因轉錄水平。 2、缺氧條件下體外培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元分為D組：對照組、E組：BDNF干預組；正常條件下體外培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元分為D1組：對照組、E1組：BDNF干預組。D組：培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元加入CoCl2（100μmol/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘；E組：培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元加入CoCl2（100μmol/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘后再給予BDNF（50ng/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)；D1組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘；E1組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘后給予BDNF（50ng/ml）干預并繼續(xù)培養(yǎng)。采用氯離子熒光探針（MQAE）結合激光共聚焦顯微鏡測定細胞內(nèi)氯離子熒光強度，并在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。 結果：1、無血清培養(yǎng)1d和4d的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學特征尚未發(fā)育成熟,細胞散在分布,少數(shù)細胞成團分布,胞體發(fā)亮,圓形或橢圓形。而無血清培養(yǎng)7d皮質(zhì)神經(jīng)元胞體飽滿成錐體形且發(fā)亮，邊緣有光暈，突起較多，，末端彼此相互連接形成復雜的神經(jīng)網(wǎng)絡。光鏡下觀察，無血清培養(yǎng)7d的皮質(zhì)神經(jīng)元NSE抗體呈陽性表達，且實驗組皮質(zhì)神經(jīng)元細胞純度為均超過90%。 2、BDNF干預未成熟組Ⅰ、BDNF干預未成熟組Ⅱ和BDNF干預成熟組中N-Shc和KCC2兩種蛋白的編碼基因轉錄水平較相應未成熟組Ⅰ、未成熟組Ⅱ、成熟組升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義，其中BDNF干預未成熟組Ⅱ中N-Shc和KCC2蛋白的編碼基因轉錄水平最高。 3、缺氧條件下：BDNF干預組與對照組相比培養(yǎng)30分鐘后胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元氯離子熒光強度較強（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。正常條件下：BDNF干預組胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)30分鐘后氯離子熒光強度較對照組強（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計學意義。 結論：1、無血清培養(yǎng)1d和4d的皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學特征尚未發(fā)育成熟；7d皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育較成熟。 2、各實驗組皮質(zhì)神經(jīng)元的純度均超過90%，適合細胞學實驗。 3、在胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中BDNF可能通過激活BDNF-N-Shc-KCC2通路，引起細胞中KCC2的表達升高。 4、通過對胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元的體外干預，模擬臨床癲癇發(fā)作時缺氧的病理狀態(tài)，我們認為缺氧條件下胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中BDNF能夠引起KCC2的表達升高。
[Abstract]:The expression and significance of the first part Egr - 4 , N - Shc and KCC in the intractable epilepsy associated with focal cortical dysplasia Objective : To investigate the expression of immediate early response gene - 4 ( Egr - 4 ) , adapter protein Shc ( N - Shc ) and K + - CL - transporter ( Kc2 ) in patients with focal cortical dysplasia ( FCDIIa ) related refractory epilepsy ( IE ) . Methods : 1 . The expression of N - Shc and KCC in 10 normal brain tissues ( experimental group ) and 10 normal brain tissues ( control group ) were detected by immunohistochemical method . The expression of N - Shc protein was detected by Western blotting . Results : 1 . Immunohistochemical staining showed that N - Shc and KCC in the control group were weakly positive , while the abnormal neurons in the experimental group were strongly positive . 2 . Western blotting : The expression of N - Shc in the experimental group was significantly higher than that in the control group . 3 銆

本文編號：1438480