本文關(guān)鍵詞：N-Shc、Egr-4和KCC2在局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良Ⅱa型相關(guān)難治性癲癇灶未成熟神經(jīng)元中的表達(dá)及相關(guān)機(jī)制研究　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分Egr-4、N-Shc和KCC2在局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良IIa型相關(guān)難治性癲癇中的表達(dá)及意義 目的：探討局灶性皮質(zhì)發(fā)育不良IIa型（FCDIIa）相關(guān)難治性癲癇（IE)致癇灶中即刻早期反應(yīng)基因-4(Egr-4)、銜接蛋白Shc（N-Shc）和K+-CL-轉(zhuǎn)運(yùn)體（KCC2）的表達(dá)情況及其意義。 方法：1、用免疫組化超敏二步法檢測(cè)10例FCDIIa相關(guān)IE組癲癇灶（實(shí)驗(yàn)組）與10例正常腦組織（對(duì)照組）中N-Shc和KCC2蛋白的表達(dá)。2、FCDIIa相關(guān)IE組癲癇灶和對(duì)照組正常腦組織各6例用Westernblotting法檢測(cè)N-Shc蛋白的表達(dá)量。3、應(yīng)用Real-time qPCR法檢測(cè)10例FCDIIa相關(guān)IE組癲癇灶（實(shí)驗(yàn)組）和10例正常腦組織（對(duì)照組）N-Shc、Egr-4和KCC2的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平。 結(jié)果：1、免疫組化：對(duì)照組中神經(jīng)元N-Shc和KCC2呈弱陽(yáng)性表達(dá)，而實(shí)驗(yàn)組中形態(tài)異常神經(jīng)元（DNs）呈強(qiáng)陽(yáng)性明顯。 2、Western blotting：實(shí)驗(yàn)組中的N-Shc的表達(dá)量明顯高于對(duì)照組。 3、Real-time qPCR:與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組中N-Shc、Egr-4和KCC2兩種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平均升高。 結(jié)論：1、DNs中N-Shc和KCC2表達(dá)異常增高可能與FCDIIa相關(guān)IE的產(chǎn)生相關(guān)。 2、在FCDIIa相關(guān)難治性癲癇中BDNF可能通過(guò)激活BDNF-SHC-KCC2和BDNF-EGR-KCC2兩條信號(hào)通路導(dǎo)致DNs中KCC2的表達(dá)增高，引起神經(jīng)元中氯離子濃度下降，最終介導(dǎo)GABA的抑制性效應(yīng)發(fā)揮抑制癲癇的作用。 第二部分N-Shc和KCC2在胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元原代培養(yǎng)中的表達(dá)及意義 目的：探討經(jīng)BDNF干預(yù)后銜接蛋白SHC（N-Shc）和K+-CL-轉(zhuǎn)運(yùn)體（KCC2）在胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中表達(dá)的情況及其意義。 方法：1、取懷孕18天（E18）的SD大鼠，采用水合氯醛腹腔注射麻醉，酒精消毒后剖宮取出胎鼠，并在解剖顯微鏡下去除軟腦膜，運(yùn)用濃度為0.125%的胰蛋白酶消化法加機(jī)械吹打法分離細(xì)胞并在無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)；體外培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元分為A組：未成熟組Ⅰ；B組：未成熟組Ⅱ；C組：成熟組； A1組：BDNF干預(yù)組未成熟組Ⅰ；B1組：BDNF干預(yù)未成熟組Ⅱ；C1組：BDNF干預(yù)成熟組。A組：培養(yǎng)第1天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)無(wú)血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；B組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)無(wú)血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；C組：培養(yǎng)第7天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)無(wú)血培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；A1組：培養(yǎng)第1天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元加入BDNF（50ng/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；B1組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元加入BDNF（50ng/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；C1組：培養(yǎng)第7天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元加入BDNF（50ng/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)；采用細(xì)胞免疫學(xué)法檢測(cè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元的特異性烯醇化酶(NSE)的表達(dá)，在顯微鏡下觀察皮質(zhì)神經(jīng)元的生長(zhǎng)情況和純度。應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)各組胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的N-Shc和KCC2的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平。 2、缺氧條件下體外培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元分為D組：對(duì)照組、E組：BDNF干預(yù)組；正常條件下體外培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元分為D1組：對(duì)照組、E1組：BDNF干預(yù)組。D組：培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元加入CoCl2（100μmol/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘；E組：培養(yǎng)第4天胎鼠未成熟神經(jīng)元加入CoCl2（100μmol/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘后再給予BDNF（50ng/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)；D1組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘；E1組：培養(yǎng)第4天的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元經(jīng)原培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘后給予BDNF（50ng/ml）干預(yù)并繼續(xù)培養(yǎng)。采用氯離子熒光探針（MQAE）結(jié)合激光共聚焦顯微鏡測(cè)定細(xì)胞內(nèi)氯離子熒光強(qiáng)度，并在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。 結(jié)果：1、無(wú)血清培養(yǎng)1d和4d的胎鼠皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征尚未發(fā)育成熟,細(xì)胞散在分布,少數(shù)細(xì)胞成團(tuán)分布,胞體發(fā)亮,圓形或橢圓形。而無(wú)血清培養(yǎng)7d皮質(zhì)神經(jīng)元胞體飽滿成錐體形且發(fā)亮，邊緣有光暈，突起較多，，末端彼此相互連接形成復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。光鏡下觀察，無(wú)血清培養(yǎng)7d的皮質(zhì)神經(jīng)元NSE抗體呈陽(yáng)性表達(dá)，且實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞純度為均超過(guò)90%。 2、BDNF干預(yù)未成熟組Ⅰ、BDNF干預(yù)未成熟組Ⅱ和BDNF干預(yù)成熟組中N-Shc和KCC2兩種蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平較相應(yīng)未成熟組Ⅰ、未成熟組Ⅱ、成熟組升高（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中BDNF干預(yù)未成熟組Ⅱ中N-Shc和KCC2蛋白的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平最高。 3、缺氧條件下：BDNF干預(yù)組與對(duì)照組相比培養(yǎng)30分鐘后胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元氯離子熒光強(qiáng)度較強(qiáng)（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常條件下：BDNF干預(yù)組胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)30分鐘后氯離子熒光強(qiáng)度較對(duì)照組強(qiáng)（P＜0.01），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：1、無(wú)血清培養(yǎng)1d和4d的皮質(zhì)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征尚未發(fā)育成熟；7d皮質(zhì)神經(jīng)元發(fā)育較成熟。 2、各實(shí)驗(yàn)組皮質(zhì)神經(jīng)元的純度均超過(guò)90%，適合細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)。 3、在胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中BDNF可能通過(guò)激活BDNF-N-Shc-KCC2通路，引起細(xì)胞中KCC2的表達(dá)升高。 4、通過(guò)對(duì)胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元的體外干預(yù)，模擬臨床癲癇發(fā)作時(shí)缺氧的病理狀態(tài)，我們認(rèn)為缺氧條件下胎鼠未成熟皮質(zhì)神經(jīng)元中BDNF能夠引起KCC2的表達(dá)升高。
[Abstract]:The expression and significance of the first part Egr - 4 , N - Shc and KCC in the intractable epilepsy associated with focal cortical dysplasia Objective : To investigate the expression of immediate early response gene - 4 ( Egr - 4 ) , adapter protein Shc ( N - Shc ) and K + - CL - transporter ( Kc2 ) in patients with focal cortical dysplasia ( FCDIIa ) related refractory epilepsy ( IE ) . Methods : 1 . The expression of N - Shc and KCC in 10 normal brain tissues ( experimental group ) and 10 normal brain tissues ( control group ) were detected by immunohistochemical method . The expression of N - Shc protein was detected by Western blotting . Results : 1 . Immunohistochemical staining showed that N - Shc and KCC in the control group were weakly positive , while the abnormal neurons in the experimental group were strongly positive . 2 . Western blotting : The expression of N - Shc in the experimental group was significantly higher than that in the control group . 3 銆

本文編號(hào)：1438480