本文關(guān)鍵詞：自體PRP對成骨細(xì)胞骨涎蛋白表達(dá)的影響　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的：隨著人們生活水平的提高，人們對口腔種植的需求逐漸增加。自從上個(gè)世紀(jì)60年代，由Branemark教授等提出種植體-骨界面的“骨結(jié)合”理論，種植技術(shù)和理論研究得到飛快的發(fā)展。目前口腔種植中常見的問題主要為不能形成良好骨結(jié)合和局部骨量不足的問題，為了解決這個(gè)問題，很多學(xué)者做了大量的相關(guān)研究。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是組織工程理想的種子細(xì)胞，它可以在體外定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。富血小板血漿（PRP）被刺激后可以釋放大量的生長因子，這些生長因子可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)和重建。骨涎蛋白（BSP）是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，在成骨細(xì)胞礦化的晚期特異性表達(dá)。本研究體外誘導(dǎo)兔BMSCs分化為成骨細(xì)胞，將兔全血所制備的自體PRP作用于成骨細(xì)胞，探討自體PRP在不同時(shí)間段對成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響，進(jìn)一步揭示PRP的作用機(jī)制，為臨床中合理使用PRP提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：①BMSCs的培養(yǎng)：將3月齡新西蘭大白兔以戊巴比妥鈉經(jīng)耳緣靜脈麻醉，以16號(hào)骨髓穿刺針抽取脛骨骨髓4-6ml離心后接種于培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞達(dá)到70~80％貼壁融合后進(jìn)行傳代，用倒置顯微鏡觀察原代及傳代細(xì)胞形態(tài)。②繪制細(xì)胞生長曲線：將生長良好第三代BMSCs配制成1.0×104/ml的BMSCs細(xì)胞懸液，并接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，每天取出一組進(jìn)行計(jì)數(shù)，每組設(shè)3復(fù)孔，連續(xù)觀察10天后繪制細(xì)胞的生長曲線。③PRP的制備：取同一只新西蘭大白兔，經(jīng)耳緣靜脈麻醉，分離頸總動(dòng)脈并抽取全血，采用二次離心法分離兔全血并制備PRP，并在檢驗(yàn)室檢測所制備PRP和兔全血血小板數(shù)目。新鮮獲取的PRP以牛凝血酶激活后，立即加入到細(xì)胞培養(yǎng)系中。④實(shí)驗(yàn)分組：實(shí)驗(yàn)組加入含20％PRP的含礦化誘導(dǎo)液的無血清完全DMEM培養(yǎng)液；對照組加入不含PRP的含礦化誘導(dǎo)液的無血清完全DMEM培養(yǎng)液。每組設(shè)3復(fù)孔。⑤成骨細(xì)胞的鑒定：取第3代生長良好的BMSCs用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)后，以堿性磷酸酶染色法及鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色法驗(yàn)證其具有成骨分化能力。⑥成骨細(xì)胞增殖檢測：應(yīng)用MTT法分別檢測第1、4、7、10d實(shí)驗(yàn)組和對照組中成骨細(xì)胞的增殖情況，其中每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。⑦成骨細(xì)胞堿性磷酸酶活性檢測：應(yīng)用堿性磷酸酶檢測試劑盒分別檢測第4、7、10、14d實(shí)驗(yàn)組和對照組細(xì)胞中堿性磷酸酶的含量，每組設(shè)定3個(gè)復(fù)孔。⑧成骨細(xì)胞骨涎蛋白表達(dá)檢測：通過蛋白質(zhì)印跡法(Western-blot)分別檢測第4、9、14、19、24d實(shí)驗(yàn)組和對照組中成骨細(xì)胞骨涎蛋白的表達(dá)情況。 結(jié)果：①BMSCs細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：原代培養(yǎng)5d后，細(xì)胞呈短梭形、梭形、三角形或多角形，多個(gè)細(xì)胞聚集成集落，呈散在分布，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)目明顯增多，11-12d左右，可見細(xì)胞鋪滿瓶底的80-90%，貼壁細(xì)胞呈長梭形、紡錘形排列，緊密排列類似集束狀、漩渦狀，傳代后的細(xì)胞增殖速度明顯加快，傳3代以后細(xì)胞形態(tài)較為均一，細(xì)胞數(shù)量增多，形態(tài)呈現(xiàn)長梭形或者紡錘體樣，細(xì)胞整體呈魚群樣、漩渦狀或平行排列。細(xì)胞的生長曲線顯示：1-2d為潛伏期，細(xì)胞增殖不明顯，，3d后細(xì)胞增殖明顯加快，進(jìn)入對數(shù)生長期，7d后增殖變慢為平臺(tái)期，之后細(xì)胞數(shù)目趨于平緩。②成骨細(xì)胞的鑒定：經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，堿性磷酸酶染色和鈣結(jié)節(jié)茜素紅染色結(jié)果均呈陽性表達(dá)，表明所培養(yǎng)的BMSCs可以體外誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞，并具有礦化能力。③PRP的檢測：PRP中的血小板數(shù)目為855±27×109/L，全血中血小板數(shù)目為203±33×109/L，PRP中血小板數(shù)目為全血的4.2倍，符合實(shí)驗(yàn)要求。④MTT檢測增殖結(jié)果：實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在第7d時(shí)實(shí)驗(yàn)組獲得最高OD值，對照組各時(shí)間點(diǎn)之間無明顯變化。⑤堿性磷酸酶活性檢測：實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)均明顯高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且在第10d時(shí)實(shí)驗(yàn)組獲得最高OD值，對照組各時(shí)間點(diǎn)之間無明顯變化。⑥Western blot檢測骨涎蛋白的表達(dá)水平：實(shí)驗(yàn)組各檢測時(shí)間點(diǎn)的灰度值均高于對照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），第19d時(shí)實(shí)驗(yàn)組灰度值最高。 結(jié)論：①兔BMSCs在體外可誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。②采用二次離心法可制備出高濃度的富血小板血漿，在體外能夠促進(jìn)兔成骨細(xì)胞的增殖和分化。增殖作用最強(qiáng)在PRP作用第7d，分化能力最強(qiáng)在PRP作用第10d。③自體PRP能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞中骨涎蛋白的表達(dá)，且第19d表達(dá)水平最高。推測PRP能夠通過促進(jìn)骨涎蛋白表達(dá)而發(fā)揮其促進(jìn)成骨的作用。
[Abstract]:Objective : In order to solve this problem , bone marrow stromal cells ( BSCs ) are the ideal seed cells of tissue engineering . Bone marrow stromal cells ( BSCs ) are the ideal seed cells of tissue engineering . Bone marrow stromal cells ( BSCs ) are the ideal seed cells for osteoblast differentiation . Methods : 鈶

本文編號(hào)：1418547