本文關(guān)鍵詞：分離自商陸的根際真菌SL-30殺滅釘螺作用研究

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【摘要】：釘螺是日本血吸蟲的唯一中間宿主,因此殺滅釘螺是預(yù)防和控制血吸蟲病流行的重要措施之一。目前使用的滅螺藥物不同程度地存在成本高昂、選擇性較弱、持久性差、易造成環(huán)境污染等不足,限制了其廣泛應(yīng)用。本研究從植物根際環(huán)境篩選殺螺活性微生物,旨在尋找高效安全的微生物來源殺螺活性成分,并探索殺螺活性微生物可行的原位應(yīng)用方式,以補充化學(xué)滅螺藥物的不足。主要結(jié)果如下： 1、對14種具有殺螺活性的藥用植物的根際土進(jìn)行微生物分離,最終從商陸根際分離篩選到一株具有顯著殺螺活性的真菌菌株SL-30,其4%發(fā)酵液24 h殺螺率達(dá)100%,且該濃度下對魚蝦等非靶生物無明顯毒性,且發(fā)酵液具有一定的熱穩(wěn)定性和光照穩(wěn)定性。結(jié)合菌落特征、分生孢子頭形態(tài)以及rDNA-ITS序列分析,初步將菌株SL-30鑒定為煙曲霉(Aspergillus fumigatus)。 2、以殺螺活性為檢測指標(biāo),通過單因素試驗和Plackett-Burman試驗確定可溶性淀粉用量、蛋白胨用量和初始pH是發(fā)酵液殺螺活性的主要影響因子,結(jié)合響應(yīng)面分析法,得到菌株SL-30的優(yōu)化發(fā)酵條件為：可溶性淀粉16.40 g/L,蛋白胨3.76g/L,磷酸二氫鉀0.5 g/L,硫酸鎂0.25 g/L,接種量0.5%,裝液量50 ml/250 ml,初始pH 3,培養(yǎng)溫度28℃。經(jīng)6批次發(fā)酵,結(jié)果證實該優(yōu)化條件準(zhǔn)確可靠。 3、菌株SL-30發(fā)酵液經(jīng)系統(tǒng)分離和殺螺活性檢測篩選到乙醚極性部位,經(jīng)硅膠柱層析純化得到具有高效殺螺活性的主要成分MI,其殺滅釘螺的24 h LC50值為0.101 mg/L,48 h LC50值為0.062 mg/L,72 h LC50值為0.022 mg/L,24 h LC90值為0.355 mg/L,48 h LC90值為0.121 mg/L,72 h LC90值為0.066 mg/L。經(jīng)HPLC.IFR.LC/MS/MS.1H-NMR.13C-NMR.1H-1H COSY和1H-13C HSQC等研究方法分析確定MI為膠霉毒素(gliotoxin).且殺螺活性成分MI在有效殺螺濃度下不引起魚和蛙類(蝌蚪)等非靶水生生物的死亡,對蚯蚓和土壤微生物等非靶陸地生物均為低毒。 4、經(jīng)過釘螺組織細(xì)胞Hoechst 33342染色核形分析,顯示誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不是MI致釘螺中毒和死亡的主要途徑。 5、經(jīng)光學(xué)顯微鏡和透射電鏡觀察,結(jié)果顯示MI可引起釘螺組織形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變,正常的組織形態(tài)和細(xì)胞結(jié)構(gòu)是維持機體正常生命活動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),其發(fā)生改變可導(dǎo)致組織和細(xì)胞功能異常、代謝功能障礙等,與釘螺的中毒和死亡有 一定關(guān)聯(lián)。 6、經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分析,顯示MI影響釘螺肝臟酯酶同工酶的活性和組成,干擾釘螺的解毒功能,當(dāng)MI濃度超過其解毒能力時,可導(dǎo)致釘螺中毒和死亡 7、經(jīng)酶活性測定,結(jié)果顯示MI顯著增加釘螺MDH、Na+K+-ATPase和Mg2+-ATPase的活性；顯著降低CHE活性；對AKP和GPT活性的影響為先升高后降低；SDH活性先降低后升高；LDH為頭足部酶活性增強,肝臟部位酶活性降低�？梢�,MI對釘螺機體造成很大損傷,影響釘螺體內(nèi)神經(jīng)介質(zhì)傳遞,致神經(jīng)之間的信息傳遞功能異常；對無氧呼吸、有氧呼吸位點均有作用,引起糖代謝加快使得體內(nèi)貯存消耗加速,ATP的過度利用加速能量耗竭,能量代謝的異常和各項生理功能紊亂和喪失,是引起釘螺死亡的重要原因之一。 8、通過急性毒性測試,顯示菌株SL-30的分生孢子對水體、斑馬魚和河蝦安全,對小鼠經(jīng)口、大鼠經(jīng)皮和大鼠吸入急性毒性屬于低毒級,初步得出其具有較好的生物安全性。經(jīng)根周土浸提液殺螺活性檢測,菌株SL-30接種至未滅菌的非根際土壤后第20 d開始呈現(xiàn)殺螺活性,第40 d殺螺活性基本消失；而抗性突變株Nysr-2接種至根周,至第90 d仍可檢測到一定程度的殺螺活性,且接種后60 d內(nèi)可較穩(wěn)定地定殖于根周�？梢�,菌株SL-30在土壤環(huán)境可發(fā)揮一定的殺螺活性,且在根際環(huán)境殺螺活性維持的時間更長。
【關(guān)鍵詞】：商陸 根際 微生物 殺螺活性 釘螺 機理 定殖
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R184
【目錄】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-11
• 縮略語表11-18
• 第一章 緒論18-36
• 1.1 血吸蟲病及其病原體18-21
• 1.1.1 血吸蟲病18-19
• 1.1.2 日本血吸蟲19
• 1.1.3 血吸蟲病的治療19-20
• 1.1.4 血吸蟲病的控制20-21
• 1.2 殺滅釘螺-控制血吸蟲病的重要措施21-28
• 1.2.1 釘螺的生物學(xué)分類地位與分布21
• 1.2.2 釘螺的形態(tài)與結(jié)構(gòu)21-22
• 1.2.3 殺滅釘螺的措施22-27
• 1.2.4 藥物滅螺的機理27-28
• 1.3 殺蟲類微生物農(nóng)藥28-31
• 1.3.1 殺蟲類微生物農(nóng)藥種類29-30
• 1.3.2 微生物農(nóng)藥的安全性評價30-31
• 1.4 根際微生物31-33
• 1.4.1 根際與根際微生物31
• 1.4.2 具有抑菌殺蟲效果的根際微生物31-32
• 1.4.3 目的菌株的應(yīng)用方式32-33
• 1.5 本論文的立題依據(jù)和主要研究內(nèi)容33-36
• 第二章 根際殺螺活性微生物的篩選36-56
• 2.1 材料36-38
• 2.1.1 生物材料36
• 2.1.2 培養(yǎng)基36-37
• 2.1.3 主要試劑37
• 2.1.4 主要儀器37-38
• 2.2 方法38-43
• 2.2.1 根際土的采集38-39
• 2.2.2 菌株的分離純化39
• 2.2.3 殺螺活性菌株的篩選39-40
• 2.2.4 殺螺活性菌株發(fā)酵液對魚蝦的急性毒性測定方法40
• 2.2.5 多糖和蛋白成分的影響40
• 2.2.6 發(fā)酵液穩(wěn)定性檢測40-41
• 2.2.7 發(fā)酵液對釘螺軟體組織重量、糖原和總蛋白含量的影響41
• 2.2.8 菌株SL-30的鑒定方法41-43
• 2.3 結(jié)果與分析43-55
• 2.3.1 殺螺活性菌株篩選結(jié)果43-45
• 2.3.2 菌株SL-30和YT-16發(fā)酵液殺螺活性比較45-46
• 2.3.3 菌株SL-30和YT-16發(fā)酵液對魚蝦的急性毒性46-48
• 2.3.4 菌株SL-30發(fā)酵液LC_(50)值和LC_(90)值的測定結(jié)果48-49
• 2.3.5 菌株SL-30發(fā)酵液的穩(wěn)定性49-51
• 2.3.6 菌株SL-30發(fā)酵液對釘螺軟體組織影響51-52
• 2.3.7 菌株SL-30的鑒定結(jié)果52-55
• 2.4 本章小結(jié)與討論55-56
• 第三章 菌株SL-30發(fā)酵條件的優(yōu)化56-72
• 3.1 材料56
• 3.1.1 生物材料56
• 3.1.2 主要試劑56
• 3.1.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基56
• 3.1.4 儀器設(shè)備56
• 3.2 方法56-59
• 3.2.1 菌株SL-30生物量和發(fā)酵液殺螺活性變化曲線測定56-57
• 3.2.2 殺螺活性測試57
• 3.2.3 單因素試驗57
• 3.2.4 PLACKETT-BURMAN試驗57-58
• 3.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計58-59
• 3.2.6 模型驗證59
• 3.3 結(jié)果與分析59-71
• 3.3.1 菌株SL-30生物量和發(fā)酵液殺螺活性隨時間變化的測定59-60
• 3.3.2 單因素試驗結(jié)果60-65
• 3.3.3 PLACKETT-BURMAN試驗結(jié)果65-66
• 3.3.4 BOX-BEHNKEN響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果66-70
• 3.3.5 模型驗證70-71
• 3.4 本章小結(jié)與討論71-72
• 第四章 殺螺有效成分的分離及鑒定72-94
• 4.1 材料72-73
• 4.1.1 生物材料72
• 4.1.2 主要試劑72
• 4.1.3 儀器設(shè)備72-73
• 4.2 方法73-77
• 4.2.1 菌株SL-30發(fā)酵液系統(tǒng)分離73
• 4.2.2 乙醚極性部位殺螺活性成分的分離純化73-75
• 4.2.3 MI的殺螺活性驗證75
• 4.2.4 MI的化學(xué)結(jié)構(gòu)鑒定75
• 4.2.5 MI對非靶生物的毒性測試75-77
• 4.3 結(jié)果與分析77-92
• 4.3.1 菌株SL-30發(fā)酵液殺螺活性部位篩選77-78
• 4.3.2 殺螺有效成分MI的分離純化78-81
• 4.3.3 MI的殺螺活性81-82
• 4.3.4 MI的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析82-88
• 4.3.5 MI對非靶生物的毒性88-92
• 4.4 本章小結(jié)與討論92-94
• 第五章 有效成分MI對釘螺組織及細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)影響94-104
• 5.1 材料94-95
• 5.1.1 生物材料94
• 5.1.2 主要試劑94
• 5.1.3 主要儀器94-95
• 5.2 方法95
• 5.2.1 釘螺的浸殺處理95
• 5.2.2 細(xì)胞凋亡形態(tài)檢測95
• 5.2.3 組織形態(tài)觀察95
• 5.2.4 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察95
• 5.3 結(jié)果與分析95-103
• 5.3.1 MI對釘螺細(xì)胞凋亡的影響95-96
• 5.3.2 MI對組織形態(tài)的影響96-98
• 5.3.3 MI對釘螺細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響98-103
• 5.4 本章小結(jié)與討論103-104
• 第六章 有效成分MI對釘螺部分酶活力的影響104-122
• 6.1 材料104-105
• 6.1.1 生物材料104
• 6.1.2 主要試劑104-105
• 6.1.3 主要儀器105
• 6.2 方法105-107
• 6.2.1 釘螺處理105
• 6.2.2 酶的提取105-106
• 6.2.3 酯酶同工酶電泳106-107
• 6.2.4 酶活測定107
• 6.2.5 數(shù)據(jù)處理107
• 6.3 結(jié)果及分析107-119
• 6.3.1 殺螺有效成分MI對釘螺酯酶同工酶的影響107-109
• 6.3.2 殺螺有效成分MI對釘螺部分酶活的影響109-119
• 6.4 本章小結(jié)與討論119-122
• 第七章 菌株SL-30的生物安全性初步檢測122-132
• 7.1 材料122-123
• 7.1.1 生物材料122
• 7.1.2 主要試劑122
• 7.1.3 儀器設(shè)備122-123
• 7.2 方法123-124
• 7.2.1 菌株SL-30孢子在水體中的檢測123
• 7.2.2 菌株SL-30孢子對魚蝦安全性試驗123
• 7.2.3 小鼠經(jīng)口急性毒性試驗123
• 7.2.4 大鼠經(jīng)皮急性毒性試驗123-124
• 7.2.5 大鼠吸入急性毒性試驗124
• 7.2.6 病理切片觀察124
• 7.2.7 數(shù)據(jù)處理124
• 7.3 結(jié)果與分析124-131
• 7.3.1 菌株SL-30孢子在水體中的存活結(jié)果124-125
• 7.3.2 菌株SL-30孢子對魚蝦的安全性測定結(jié)果125-126
• 7.3.3 小鼠急性經(jīng)口毒性126-127
• 7.3.4 大鼠急性經(jīng)皮毒性127-129
• 7.3.5 大鼠急性吸入毒性129-131
• 7.4 本章小結(jié)與討論131-132
• 第八章 菌株接種土壤環(huán)境的殺螺作用初探132-144
• 8.1 材料132-133
• 8.1.1 生物材料132
• 8.1.2 主要試劑132-133
• 8.1.3 儀器設(shè)備133
• 8.2 方法133-135
• 8.2.1 菌株SL-30接種非根周土的殺螺活性測定133-134
• 8.2.2 菌株SL-30接種植物根周環(huán)境的殺螺活性測定134-135
• 8.2.3 數(shù)據(jù)處理135
• 8.3 結(jié)果與分析135-142
• 8.3.1 接種非根周土的殺螺活性結(jié)果135-138
• 8.3.2 接種根周環(huán)境的殺螺活性結(jié)果138-142
• 8.4 本章小結(jié)與討論142-144
• 第九章 論文創(chuàng)新點、主要結(jié)論及工作展望144-146
• 參考文獻(xiàn)146-162
• 致謝162-163
• 學(xué)習(xí)期間發(fā)表的論文163

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