發(fā)布時間：2017-05-13 11:13

  本文關(guān)鍵詞：淡色庫蚊溴氰菊酯抗性基因XN-P450的克隆、分析及CYP6F1的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：淡色庫蚊是一種分布極廣的全球性衛(wèi)生害蟲，能夠傳播多種致命疾病。對其的防治主要是使用各類化學殺蟲劑，這引起了殺蟲劑抗性的產(chǎn)生和發(fā)展。淡色庫蚊抗性機理及抗性基因的研究成為熱點。本論文以淡色庫蚊為材料進行了以下三方面的實驗： 1.比較使用了五種改良的方法：異硫氰酸胍法、Trizol法、Trizol+CTAB法、改良的Trizol法和CTAB法，從淡色庫蚊抗性品系中提取總RNA，通過對所提總RNA的純度、濃度、完整性以及耗用時間等方面進行比較，并以實時熒光定量PCR的方法來定量比較了五種方法所提取產(chǎn)物中RNA的拷貝數(shù)，結(jié)果顯示：改良的CTAB法為淡色庫蚊總RNA提取的最優(yōu)法。 2.以淡色庫蚊抗性相關(guān)的EST（EC093830.1）序列為模板，設(shè)計基因特異性引物，通過RACE的方法克隆得到了長為1637bp的cDNA全長序列——XN-P450。確定其開放閱讀框長1521bp，通過軟件對其進行氨基酸、跨膜區(qū)、亞細胞定位、二級結(jié)構(gòu)及酶切位點等的預測。結(jié)果表明XN-P450編碼蛋白質(zhì)有506個氨基酸，二級結(jié)構(gòu)有53.16%的α螺旋，14.62%的β折疊及32.21%的環(huán)，含4個主要的跨膜螺旋；經(jīng)亞細胞定位發(fā)現(xiàn)該蛋白多定位于線粒體和細胞質(zhì)，且多在分泌通道部位，有多種酶類的切割位點，這些都指明了該蛋白是一類能夠參與代謝、分泌等多種反應(yīng)的膜蛋白，推測其參與了淡色庫蚊的代謝抗性；通過定量PCR發(fā)現(xiàn)XN-P450在淡色庫蚊抗性中的表達量是敏感品系的1.58倍，這進一步證實其在淡色庫蚊的抗藥性中扮演著代謝抗性執(zhí)行者的角色。 3. CYP6FI是淡色庫蚊抗性基因中研究比較透徹且比較典型的一例，該基因有著抗性代謝解毒酶基因最大一類的細胞色素P450的一些保守特征。本研究合成特異性引物，并以淡色庫蚊不同發(fā)育時期的幼蟲、蛹及成蟲所提RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，進行定量PCR鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)CYP6FI對于β-actin的相對表達量在淡色庫蚊體內(nèi)隨著發(fā)育時期的延長在不斷增加，即相對于比較敏感的幼蟲，具有抗性的成蟲中該基因是超表達的。 綜上所述，以篩選得到的最合適淡色庫蚊RNA提取的方法為基礎(chǔ)，克隆得到抗性基因XN-P450，分析其結(jié)構(gòu)及所編碼的蛋白質(zhì)序列，預測其功能，并檢測其在抗性與敏感品系中的表達差異，以確定該基因與抗性的相關(guān)性；定量檢測CYP6FI在不同發(fā)育時期的表達量的變化趨勢。通過以上三部分研究為淡色庫蚊總RNA提取找到一條最優(yōu)途徑，并且豐富了抗性基因的內(nèi)容，，為新型殺蟲劑的研發(fā)和使用提供了理論指導，共同為蚊蟲的有效防治提供理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：淡色庫蚊 抗性基因 CYP6F1 表達 生物信息學分析
【學位授予單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R184
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 第一章 文獻綜述11-24
• 1.1 蚊蟲防治和殺蟲劑抗性11-13
• 1.2 昆蟲的抗藥性機理13-17
• 1.2.1 代謝抗性13-15
• 1.2.1.1 細胞色素 P450 單加氧酶14
• 1.2.1.2 非專一性酯酶14-15
• 1.2.1.3 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶15
• 1.2.2 靶標抗性15-16
• 1.2.2.1 乙酰膽堿酯酶15
• 1.2.2.2 鈉離子通道15-16
• 1.2.2.3 γ-氨基丁酸受體氯離子通道16
• 1.2.3 抗藥性的遺傳研究16-17
• 1.3 抗性基因研究技術(shù)17-18
• 1.4 淡色庫蚊殺蟲劑抗性相關(guān)基因研究現(xiàn)狀18-22
• 1.4.1 我國近年對淡色庫蚊抗性的監(jiān)測18-19
• 1.4.2 淡色庫蚊抗性基因研究狀況19-22
• 1.4.2.1 細胞色素 P450 家族的研究19-20
• 1.4.2.3 鈉離子通道基因的研究20
• 1.4.2.4 絲氨酸蛋白酶基因家族的研究20-21
• 1.4.2.5 視蛋白基因的研究21
• 1.4.2.6 跨膜蛋白基因的研究21-22
• 1.4.2.7 蚊核糖體蛋白基因的研究22
• 1.5 研究內(nèi)容和意義22-24
• 第二章 不同方法提取淡色庫蚊總 RNA 的定量比較分析24-34
• 2.1 材料與方法24-28
• 2.1.1 總 RNA 的提取25-26
• 2.1.2 總 RNA 核酸濃度檢測與電泳檢測26
• 2.1.3 總 RNA 的純化26-27
• 2.1.4 反轉(zhuǎn)錄及其產(chǎn)物檢測27
• 2.1.5 實時熒光定量 PCR（基于標準曲線的絕對定量）27-28
• 2.2 結(jié)果與分析28-31
• 2.2.1 五種方法獲得總 RNA 的純度、產(chǎn)量及電泳檢測28-29
• 2.2.2 總 RNA 經(jīng) DnaseI 純化的結(jié)果29-30
• 2.2.3 五種方法方法耗時比較30
• 2.2.4 反轉(zhuǎn)錄及其 PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果分析30-31
• 2.2.5 五種方法所提總 RNA 定量分析31
• 2.3 討論31-34
• 第三章 淡色庫蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)基因 XN-P450 cDNA 的克隆與生物信息學分析34-45
• 3.1 材料與方法34-37
• 3.1.1 淡色庫蚊抗性與敏感品系蚊蟲的總 RNA 的提取34
• 3.1.2 cDNA 第一鏈的合成34-35
• 3.1.2.1 3’-RACE-Ready- cDNA 的合成34-35
• 3.1.2.2 5’-RACE-Ready-cDNA 的合成35
• 3.1.3 EST 的引物驗證及結(jié)果測序35
• 3.1.4 淡色庫蚊溴氰菊酯抗性相關(guān)基因的 3’、5’-RACE 擴增、檢測35-36
• 3.1.4.1 3’-RACE PCR35-36
• 3.1.4.2 5’-RACE PCR36
• 3.1.5 基因測序36
• 3.1.5.1 RACE 產(chǎn)物的純化36
• 3.1.5.2 克隆36
• 3.1.5.3 陽性克隆檢測36
• 3.1.5.4 測序結(jié)果的比對分析36
• 3.1.6 全長 cDNA 的擴增36
• 3.1.7 生物信息學分析36-37
• 3.1.8 定量分析37
• 3.2 實驗結(jié)果與分析37-43
• 3.2.1 抗性與敏感品系庫蚊的總 RNA 提取37-38
• 3.2.2 cDNA 第一鏈的合成38
• 3.2.3 EST 引物驗證38
• 3.2.4 3’、5’- RACE 擴增及測序38
• 3.2.5 全長 cDNA 的擴增38-40
• 3.2.6 全長基因的生物信息學分析40-43
• 3.2.7 定量分析該基因在兩種品系蚊蟲中的差異表達43
• 3.3 討論43-45
• 第四章 淡色庫蚊抗性基因 CYP6F1 的時序性表達45-50
• 4.1 材料與方法45-46
• 4.1.1 不同發(fā)育時期淡色庫蚊總 RNA 的提取45-46
• 4.1.2 總 RNA 的純化、反轉(zhuǎn)錄46
• 4.1.3 實時熒光定量 PCR（相對定量）46
• 4.2 結(jié)果及分析46-48
• 4.2.1 不同發(fā)育時期庫蚊總 RNA 提取的濃度和純度46
• 4.2.2 總 RNA 的純化及反轉(zhuǎn)錄46-47
• 4.2.3 定量結(jié)果47-48
• 4.3 討論48-50
• 第五章 結(jié)論50-51
• 參考文獻51-57
• 致謝57-58
• 作者簡介58

【參考文獻】

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  本文關(guān)鍵詞：淡色庫蚊溴氰菊酯抗性基因XN-P450的克隆、分析及CYP6F1的表達，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：362431