本文關鍵詞：2009~2011年廣州地區(qū)兒童手足口病柯薩奇病毒A16型（CA16）流行病學調查及CA16-IgM抗體動態(tài)規(guī)律分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：手足口病是由腸道病毒引起的急性傳染病,以腸道病毒71型(EV71)和柯薩奇病毒A組16型(CA16)感染為主。EV71病毒和CA16病毒它們的共同特點為：病毒顆粒大小為24-30nm,無外膜、單股正鏈RNA、四種顆粒蛋白(VP1-VP4)形成的五聚體、六聚體構成病毒顆粒衣殼。而EV71病毒感染更加倍受關注,因為它往往會導致嚴重的并發(fā)癥,甚至死亡,其致死原因主要為嚴重的神經病變,如腦干腦炎及無菌性腦膜炎。CA16病毒感染較EV71感染癥狀輕,但能與EV71病毒合并感染并且交替流行,近年來也頗受觀注。 這些年來,手足口病在亞太地區(qū)頻繁暴發(fā),已逐漸成為一種潛在的危害全球公共健康的疾病�？焖儆行У脑\斷能夠預防疾病傳播,減少病人死亡。診斷腸道病毒感染的方法有病毒分離,核酸檢測,血清學檢測。本研究主要內容是通過實時熒光PCR、病毒分離及中和實驗診斷方法,對2009年～2011年珠江醫(yī)院手足口病人進行病原學檢測,從而分析CA16病毒三年來流行特點；同時通過對CA16病毒VP1基因測序后構建基因進化樹,分析2010年CA16病毒基因型,為CA16病原的流行趨勢,及進化規(guī)律提供參考；根據(jù)2009-2011年手足口病人的臨床資料,分析不同腸道病毒導致心肌酶譜變化關系；此外,對收集的手足口病人血清進行CA16-IgM及EV71-IgM抗體檢測,分析CA16-IgM抗體變化動態(tài)規(guī)律及其與不同腸道病毒感染血清IgM抗體的交叉反應。通過對這些病原學資料及血清學的研究,了解手足口病CA16病毒流行趨勢及基因進化規(guī)律,對疾病的流行及暴發(fā)起到預防監(jiān)控作用。 因此,本研究分為以下兩大章節(jié)： 第一章2009-2011年廣州地區(qū)兒童手足口病柯薩奇病毒A16型(CA16)流行病學調查 2009-2011三年間南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院住院及門診臨床診斷為手足口病患者共1239例,其中男813例,女426例,門診病人525例,住院病人714例,平均年齡35個月。收集這些病人的臨床資料、肛拭子及血清標本。病人的臨床資料包括年齡、性別、發(fā)病時間,發(fā)病癥狀,心肌損傷指標,標本采集時間。肛拭子標本共采集1239份,另從住院患者中隨機獲取血清標本497份。 所有肛拭子標本進行實時熒光PCR檢測,部分標本進行病毒分離后實時熒光PCR驗證。2010年13株CA16病毒液及CA16臨床肛拭子標本進行VP1基因擴增測序,隨后進化樹分析。收集的497份急性期及恢復期血清,全部進行心肌酶譜檢測。心肌酶譜檢測指標包括：谷草轉氨酶(AST)、肌酸肌酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、羥丁酸脫氫酶(HBDH)。 2009-2011年所有臨床診斷手足口病病人中年齡最大35歲,最小1個月。說明成人兒童均可能感染手足口病。從三年的結果來看這些患兒年齡集中在5歲以內,發(fā)病高峰在1-3歲,0-1歲兒童感染例數(shù)較少。這可能是因為0-1歲兒童母體抗體的存在,導致其不易感染,發(fā)病率較低,而5歲以內兒童免疫系統(tǒng)還不完善,免疫力較低下,又無母體抗體的保護,成為手足口病的高發(fā)人群。 從性別來看2009-2011年所有臨床診斷手足口病患兒男女比例分別為：2.34：1、1.87：1及1.88：1。其中CA16病毒感染患者男女比例分別為：2.75：1、1.49：1及2.57：1。這些結果均顯示男性感染的機率高于女性,這可能是因為男孩比女孩好動,增加密切接觸腸道病毒感染物品及相互接觸傳染的機會。 本院所采集的肛拭子標本實時熒光PCR結果顯示：2009年所有臨床診斷手足口107例,檢出94例為腸道病毒感染,13例為陰性,檢出率87.85%；2010年所有臨床診斷手足口553例,檢出505例為腸道病毒感染,48例為陰性,檢出率91.32%；2011年所有臨床診斷手足口579例,檢出515例為腸道病毒感染,檢出率88.95%。三年中CA16病毒感染引起的手足口病分別占所有腸道病毒感染手足口病的43.69%(45/94)、19.80%(122/505)及20.00%(107/515)。這些數(shù)據(jù)表明CA16病毒是手足口病感染的主要病原之一,尤其2009年廣州地區(qū)流行的手足口病原以CA16為優(yōu)勢血清型,近兩年有所下降。 從時間分布來看廣州地區(qū)2009年手足口病發(fā)病高峰在4-6月；2010年手足口病發(fā)病始于3月份,發(fā)病高峰在4-7月,峰值在5月份；2011年手足口病發(fā)病高峰在5-8月份,峰值在6月份,11月份也有一個發(fā)病小高峰,所以其曲線圖呈現(xiàn)“雙峰”形狀。2009、2010年CA16病毒的流行情況與當年總的臨床診斷手足口病流行情況相似；2011年CA16病毒發(fā)病始于5月份,高峰在7-12月,峰值在11月。從臨床癥狀來看,根據(jù)2010年版的《衛(wèi)生部手足口病診療指南》,2010年手足口病重癥49例,CA16病毒引起的重癥手足口病2例,占4.08%,2011年手足口病重癥48例,只有1例是由CA16病毒引起,占2.08%�？梢奀A16病毒感染引起手足口病一般癥狀較輕,極少導致重癥。 將部分實時熒光PCR檢測為CA16病毒標本進行病毒分離培養(yǎng)后再用實時熒光PCR重新分型驗證。2009年、2010年CA16病毒共分離58例,陽性數(shù)為26,總的分離陽性率為44.83%(26/58)。經3代盲傳,病毒分離培養(yǎng)出現(xiàn)病變效應的細胞上清實時熒光PCR初步鑒定,檢測結果與原始標本實時熒光定量PCR檢測結果一致。進一步確認原始標本為CA16病毒。我們可以發(fā)現(xiàn)病毒分離方法,檢測敏感性較低。 對所收集的497份臨床診斷手足口病人血清進行心肌酶譜檢測。發(fā)病0-7天內血清為急性期血清,大于7天收集的血清為恢復期血清,其中7-14天內為恢復期(早期)血清。再將這些血清按照患者感染的不同病毒種類分為三種：EV71病毒感染組、CA16病毒感染組以及其它腸道病毒感染組。EV71病毒、CA16病毒以及其它腸道病毒感染者急性期心肌標志物異常率分別為26.60%、44.19%及45.54%。 經統(tǒng)計學分析,三種病毒心肌標志物異常率有差別(χ2=14.136,P=0.001),且CA16病毒感染組急性期血清心肌標志物異常率高于EV71病毒感染組。這一結果表明,CA16病毒感染可能更易侵犯心肌細胞,引起心肌損傷。結合上面的臨床癥狀分析結果,相比之下,EV71病毒感染更易導致重癥,引起中樞神經系統(tǒng)損傷。CA16病毒感染組急性期與恢復期(早期)比較,心肌指標CK、CK-MB差異有顯著意義(CK:t=3.621, P=0.000; CK-MB:t=3.390, P=0.001);相比這下,EV71病毒感染組兩個指標均無差異(CK:t=1.715,P=0.088; CK-MB:t=-1.221, P=0.223)。從這一結果我們可以發(fā)現(xiàn)CA16病毒感染一周后,心肌損傷有所恢復。盡管EV71病毒感染患者心肌標志物異常率低于CA16病毒感染患者,但一旦發(fā)生心肌損傷,其恢復較慢。 此外,我們還對2010年的CA16病毒株進行基因進化樹分析。19株CA16病毒成功擴增并對13株病毒VP1基因進行測序,發(fā)現(xiàn)這13株均屬于B1型,其中4株為B1b,另9株為B1a,表明病毒存在一定變異和重組或具有不同祖先來源。這13株病毒株的VP1區(qū)段與已登錄Genbank的廣東CA16序列比較：與2005年以前廣東深圳CA16序列比較,親緣關系稍遠,與2009年深圳毒株比較,親緣關系較近,原因可能是廣東深圳兩地地理位置較近,但早期毒株可能由不同祖先進化,而近期兩地毒株可能存在共同祖先；與臺灣地區(qū)CA16毒株比較結果,親緣關系也稍遠,表明毒株可能進化來源不同。 第二章CA16-IgM抗體動態(tài)規(guī)律分析 2009年3月至2010年11月南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院實驗室診斷為手足口病人中隨機抽取230人,其中男156人,女74人,年齡范圍為4～169個月,中位年齡26個月。收集這些病人從入院至出院的系列血清,共收集434份急性期和恢復期血清,血清采集時間從發(fā)病第一天至158天不等。另獲得75例呼吸道病毒感染病人系列血清105份。采用捕獲ELISA法檢測這些血清。實時熒光PCR方法檢測肛拭子標本將病毒分類分為：EV71病毒、CA16病毒及其它腸道病毒。其它腸道病毒以及呼吸道病毒感染患者血清再通過中和實驗驗證其為非EV71、CA16病毒感染。 我們對CA16病毒感染患者血清進行捕獲酶聯(lián)法檢測進而分析CA16-IgM抗體的動態(tài)變化規(guī)律。結果為：發(fā)病第一天檢出率25%,發(fā)病第二天37%,發(fā)病第三天67%,發(fā)病第五天達86%,直到發(fā)病第八天,血清CA16-IgM抗體檢出率可達100%。CA16-IgM抗體可以在發(fā)病第一天檢出,并且可以持續(xù)數(shù)周。發(fā)病20周后,IgM抗體檢出率迅速下降。發(fā)病90天后,4份血清中只有一份為弱陽性(S/Co=1.09)。 另一方面,通過對EV71病毒、其它腸道病毒、以及呼吸道病毒感染患者血清進行CA16-IgM捕獲ELISA檢測,分析其交叉反應。CA16-IgM捕獲ELISA檢測結果：211份EV71病毒感染患者血清中58份陽性,其它腸道病毒感染患者48份血清中16份陽性,呼吸道病毒感染患者血清105份中3份檢測陽性。 我們將全部66例CA16病毒感染病人119份血清分別進行EV71-IgM捕獲ELISA和CA16-IgM捕獲ELISA檢測。檢測結果表明30.3%(36/119)的CA16病毒感染病人血清,EV71-IgM抗體檢測陽性,存在交叉。然而這36份交叉血清中有33份(91.7%) CA16-IgM抗體捕獲ELISA檢測OD450值高于EV71-IgM抗體捕獲ELISA檢測。盡管存在交叉反應,但聯(lián)合兩種方法檢測,比較其OD450的比值,可以成功區(qū)分是CA16病毒感染還是與EV71病毒的交叉反應導致的假陽性。 為了比較CA16-IgM酶聯(lián)法與實時熒光PCR檢測法的一致性,我們將同一天收集的肛拭子標本和血清標本檢測結果進行比較評價。結果：兩種方法檢測CA16病毒感染無差異(McNemar檢驗P=0.148),但是Kappa value=0.276(P=0.000),相關系數(shù)偏低,表明兩種方法相關性不是很好。 總的來說CA16-IgM捕獲ELISA檢測CA16病毒感染是一種簡易、經濟的診斷方法。 小結 根據(jù)以上兩章節(jié)的研究,小結如下： 1.對2009-2011年手足口病流行病學調查,分析三年間CA16�。憾镜牧餍懈艣r。2009、2010及2011年廣州地區(qū)手足口病以CA16病毒感染占所有腸道病毒感染手足口病患者的47.87%(45/94)、19.80%(122/505)及20.00%(107/515)。廣州地區(qū)由CA16病原導致的手足口病有所下降。 2.2009、2010年CA16病毒的流行情況與當年總手足口病流行情況相似,發(fā)病高峰在4-7月；2011年CA16病毒感染導致手足口病始于5月,高峰在7-12月。三年間所有手足口患兒及CA16感染導致的手足口病均為男性患兒高于女性患兒�；純喊l(fā)病年齡集中在5歲以內,5歲以內所有手足口病患兒及CA16病毒感染患兒的比例分別為：92.11%、96.35%。 3.CA16病毒感染患兒急性期心肌酶標志物異常率高于EV71感染患兒。CA16病毒感染患兒急性期(0-7天)與恢復早期(8-14天)CK-MB均有差異。EV71病毒感染患兒急性期與恢復早期CK-MB統(tǒng)計無差異。這一結果表明CA16病毒比EV71病毒可能更易親嗜心肌細胞,但心肌酶標志物恢復正常較EV71病毒感染快。 4.對13株2010年CA16病毒VPl基因擴增后測序,進化樹分析結果為B1型。說明2010年廣州地區(qū)流行的CA16病毒可能為B1型。 5. CA16-IgM抗體動態(tài)規(guī)律研究表明：CA16-IgM抗體不僅可以在發(fā)病第一天產生,并且可以持續(xù)數(shù)周,直到發(fā)病第八天,血清CA16-IgM抗體檢出率可達100%。發(fā)病20周后,IgM抗體檢出率迅速下降。發(fā)病90天后,4份血清中只有一份檢出很微弱的陽性(S/Co=1.09). 6.由于腸道病毒間存在一些同源性,有共同的氨基酸序列,故CA16-IgM檢測存在一定交叉反應。分別對EV71病毒、其它腸道病毒、以及呼吸道病毒感染患者血清進行CA16-IgM捕獲ELISA檢測,檢測結果陽性率分別為：27.48%(58/211)、33.33%(16/48)及2.86%(3/105)。盡管存在交叉反應,但聯(lián)合EV71-IgM及CA16-IgM捕獲ELISA兩種方法檢測,比較其OD450的比值,可以成功區(qū)分是CA16病毒感染還是與EV71的交叉反應導致的假陽性。 7.對來自同一天收集的肛拭子標本及血清標本進行檢測,比較實時熒光PCR與CA16-IgM捕獲ELISA方法一致性,統(tǒng)計結果表明兩種方法沒有差異,但相關系數(shù)不高�？傊�,CA16-IgM酶聯(lián)檢測法可以在手足口病大規(guī)模流行時進行早期診斷復查,適合在沒有開展分子生物學診斷方法的基層醫(yī)院使用。
【關鍵詞】：手足口病 CA16 實時熒光PCR IgM捕獲ELISA CA16基因進化樹
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R725.1;R181.3
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-18
• 前言18-23
• 參考文獻20-23
• 第一章 2009～2011年廣州地區(qū)兒童手足口病柯薩奇病毒A16型(CA16)的流行病學調查23-44
• 1. 引言23
• 2. 材料和方法23-31
• 3. 結果31-40
• 4. 討論40-43
• 5. 參考文獻43-44
• 第二章 CA16-IgM抗體動態(tài)規(guī)律分析44-58
• 1. 引言44
• 2. 材料和方法44-49
• 3. 結果49-54
• 4. 討論54-57
• 5. 參考文獻57-58
• 全文小結58-60
• 綜述60-70
• 參考文獻66-70
• 縮寫詞簡表70-71
• 致謝71-72
• 碩士研究生期間發(fā)表論文72-74
• 統(tǒng)計學審稿證明74

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前4條

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  本文關鍵詞：2009~2011年廣州地區(qū)兒童手足口病柯薩奇病毒A16型（CA16）流行病學調查及CA16-IgM抗體動態(tài)規(guī)律分析，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號：357587