【摘要】： 球形芽胞桿菌(Bacillus sphaericus，簡稱Bs)和蘇云金芽胞桿菌以色列亞種(Bacillus thuringiensis subsp．israelensis，簡稱Bti)是目前在世界范圍內(nèi)被成功應(yīng)用于疾病媒介蚊蟲生物防治的好氧芽胞桿菌。它們的殺蚊活性都依賴于在芽胞期產(chǎn)生的晶體蛋白，球形芽胞桿菌的晶體蛋白是由二元毒素(Binary toxins，Bin)組成，重復使用單一的二元毒素易致蚊幼蟲產(chǎn)生抗性；而Bti的晶體蛋白則由多種毒素蛋白組成。 廣泛存在于自然界中的幾丁質(zhì)酶(Chitinase，EC 3.2.1.14)可水解昆蟲中腸圍食膜上的幾丁質(zhì)，使圍食膜成型延遲或形成穿孔，有利于其他毒素更好的發(fā)揮作用而成為一種重要的生物防治因子。為探究幾丁質(zhì)酶在蚊蟲防治中的具體作用，，本論文對幾丁質(zhì)酶對蚊蟲的毒力、幾丁質(zhì)酶基因的克隆和表達、幾丁質(zhì)酶同晶體毒素蛋白對蚊幼蟲的協(xié)同毒殺作用進行了研究。 首先測定了高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶菌株粘質(zhì)沙雷氏菌(Serretia marcescens)幾丁質(zhì)酶的殺蚊活性，證明幾丁質(zhì)酶對致倦庫蚊(Culex quinquefasciatus)幼蟲具有一定的毒力，但毒力較低，其LC_(50)和LC_(90)分別為8.99μg／ml和28.5μg／ml。同時，單獨的幾丁質(zhì)酶對蚊幼蟲還具有一定的后致死作用。當幾丁質(zhì)酶與二元毒素共同作用于敏感致倦庫蚊幼蟲時，幾丁質(zhì)酶表現(xiàn)出明顯的對二元毒素的增效作用。 采用特異性PCR和幾丁質(zhì)酶活性測定方法對本實驗室保存的芽胞桿菌菌株的幾丁質(zhì)酶基因和酶活性進行了檢測，表明所有球形芽胞桿菌標準血清型菌株均不含幾丁質(zhì)酶基因和不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，26株蠟狀芽胞桿菌(B．cereus)野生菌株有25株可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶活性，而蘇云金芽胞桿菌的31個標準血清型菌株和31個野生型菌株中只有4個野生型菌株不含有幾丁質(zhì)酶基因和不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。 對篩選出的三株高幾丁質(zhì)酶活性的蘇云金芽胞桿菌菌株T04A001、T13003及Gr-9的幾丁質(zhì)酶基因進行了克隆和序列測定，三個幾丁質(zhì)酶基因具有98％相似性，其編碼的蛋白均由四個高度保守的主要功能域組成，即信號肽區(qū)、催化區(qū)、粘蛋白Ⅲ型類似區(qū)及幾丁質(zhì)結(jié)合區(qū)。在此基礎(chǔ)上，完成了來源于T04A001菌株的幾丁質(zhì)酶基因chiAC ORF在T7啟動子控制下的原核融合表達。重組菌株E-pETC21在1 mM IPTG誘導的條件下可大量表達產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，酶活最高可達到約420 U／ml。SDS-PAGE及Western blot分析顯示，E-pETC21在產(chǎn)生70 kDa ChiAC表達帶的同時，還可產(chǎn)生兩條大小分別為40 kDa和29 kDa的降解帶。 將chiAC分別在自身營養(yǎng)期啟動子和二元毒素芽胞特異性啟動子調(diào)控下在殺蚊細菌野生菌Bti IPS78和Bs 2297中表達，得到的重組菌株分別在營養(yǎng)體時期和芽胞形成期能表達產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶。幾丁質(zhì)酶在營養(yǎng)期的大量表達對重組菌株Bti-pBC的芽胞形成有一定的影響，隨之也影響了重組菌株對蚊幼蟲的毒力，但對重組菌株2297-pBC的芽胞形成及殺蚊毒力則沒有顯著影響。幾丁質(zhì)酶在芽胞形成期的表達對重組菌株Bti-pabC和2297-pBbC生長和芽胞形成沒有影響。生物測定表明，在芽胞期表達幾丁質(zhì)酶的重組菌株對庫蚊幼蟲的毒力較野生菌株高。由于表達的外源幾丁質(zhì)酶對二元毒素的增效作用，重組菌株2297-pBbC對抗性蚊蟲的毒力比野生菌株高約4，700倍。為今后為幾丁質(zhì)酶在蚊蟲的生物防治中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

幾丁質(zhì)酶和殺蟲晶體蛋白對蚊蟲的協(xié)同毒殺作用菌體一端膨大，因此抱子囊呈鼓糙狀;在抱子囊成熟后，其伴抱晶體和芽胞仍保持結(jié)合狀態(tài)，兩者同被包在芽胞外膜內(nèi)(圖1一1)121。圖1一1球形芽胞桿菌的晶體131球形芽胞桿菌在1904年作為一個獨立的種被確立，直到1964年Kenen才分離篩選到第一株對蚊幼蟲有毒力的球形芽胞桿菌菌株(S儷nK)[’l。盡管這株低毒力菌株需要七天才能使蚊幼蟲致死，然而使球形芽胞桿菌作為蚊幼蟲病原菌由此而開始為人們所了解。此后人們一直持續(xù)不斷的篩選對蚊幼高毒力的球形芽胞桿菌菌株。1976年，singer等首次分離到一株高毒力菌株1593[sl。之后便有更多的具有高效殺蚊活性的球形芽胞桿菌菌株被分離，如2297I’l、2362Iv]、認B59[8l和c3一1[91等。Bs通常采用DNA同源性分析，鞭毛血清抗原分析和對噬菌體敏感性實驗等方法進行種內(nèi)鑒定。DNA同源性分析從兩個方面評價:一是總組成定量其分子量的大小，二是G+C的摩爾百分比(GC%)，所有的有毒菌株都具有較高的DNA同源性(>79%)。因為噬菌體的宿主專一性

和硫酸錢沉淀法得到的幾丁質(zhì)酶經(jīng)過透析后，測得其蛋白濃度為200林創(chuàng)加1，幾丁質(zhì)酶比活力為 500Ulml。SDS.PAGE分析顯示，沙雷氏菌s3菌株的幾丁質(zhì)酶主要由大小約58、51、39、29及 21kDa的五種幾丁質(zhì)酶組成(見圖2一l)。圖2一11:標準分子量R嘆einM出火er;2:純化的幾丁質(zhì)酶s.m。甲亡e‘c曰”s3菌株純化的幾丁質(zhì)酶。2.2.2二元毒素的晶體提純液體雙相法提純得到的B.甲 haericoC3碑1菌株伴胞晶體經(jīng)過冷凍干燥，稱重得其蛋白量，一20℃保存。使用時溶于適量雙蒸水。SDS.PAGE分析顯示晶體主要由 42kDa和 51kDa的二元毒素組成。 kDa1266.24535贏)翰澎鬢圖2一2純化的二元毒素1:標準分子量P舊 telnMaJ業(yè) er;2:BsC341菌株提純晶體蛋白。
【學位授予單位】：中國科學院研究生院（武漢病毒研究所）
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R184

【引證文獻】

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1 時杰;廢棄蝦蟹殼的資源化利用技術(shù)研究[D];海南大學;2011年

本文編號：2521298