【摘要】：研究背景和目的 流行性乙型腦炎(epidemic encephalitis B),也稱為日本腦炎(Japaneseencephalitis,JE),簡稱乙腦,是重要的蟲媒病毒傳染病,其病原體為乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV),簡稱乙腦病毒。本病1871年首先由日本報(bào)道,1924年首次分離出乙腦病毒,中國于1940年用血清學(xué)和病毒分離的方法確診了乙腦病例。多數(shù)國家每2～15年出現(xiàn)1次乙腦流行。世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì),目前每年乙腦發(fā)病約5萬例,其中約1/3的病例死亡,存活者20%～40%留有神經(jīng)麻痹和心理改變等嚴(yán)重后遺癥,曾一度被稱為“東方的瘟疫”,給社會和家庭造成了巨大的負(fù)擔(dān)。 一般認(rèn)為,JEV在庫蚊和野生水鳥之間的循環(huán),豬是重要的擴(kuò)散宿主。乙腦的傳播媒介是蚊蟲,在世界范圍內(nèi)已報(bào)道從30種不同的蚊蟲體內(nèi)分離出乙腦病毒,國內(nèi)也有20余種,三帶喙庫蚊是其中對JEV易感性最高的蚊種,JEV通過三帶喙庫蚊在野生鳥類、人和家畜之間傳播。 一般來說蟲媒病毒都具有宿主泛嗜性,除了鳥類和豬以外,JEV還可以感染綿羊、家燕、猴子、金黃地鼠、小白鼠并可致病。國內(nèi)學(xué)者曾報(bào)道從云南、廣西、廣東、海南、安徽、貴州的蝙蝠檢測到JEV血清抗體。但尚沒有分離到JEV或檢測到JEV核酸的報(bào)道。 湖南省是我國乙腦發(fā)病較多的地區(qū)之一,湖南省的蝙蝠能否攜帶JEV?如果攜帶該病毒,與人類乙腦有無關(guān)系?為此我們進(jìn)行了本調(diào)查。 研究方法 1.標(biāo)本來源與制備 2007年至2008年期間4次收集湖南部分地區(qū)的蝙蝠共851只。收集的蝙蝠鑒定種類后無菌解剖取腦組織標(biāo)本,所取得標(biāo)本放入1.5ml含RNAlater的凍存管中4℃運(yùn)輸送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步處理。腦組織標(biāo)本加Hanks緩沖溶液用高壓消毒過的微量研磨器無菌研磨,研磨液離心后取部分上清進(jìn)行PCR檢測和細(xì)胞培養(yǎng),剩余標(biāo)本放置-80℃保存。 2.RT-PCR 以JEV的E蛋白基因區(qū)和C/prM蛋白基因區(qū)為靶序列設(shè)計(jì)了一對特異RT-PCR引物和兩對通用RT-PCR引物。先用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN公司)提取腦組織研磨液中的核糖核酸(RNA),用SUPERSCRIPTⅢ1ST STRAND(invitrogen公司)逆轉(zhuǎn)錄酶體系和隨機(jī)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(RT)合成cDNA;以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測所采集蝙蝠標(biāo)本中的JEV有關(guān)基因片段。 3.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)RT-PCR ①引用已得到證實(shí)和公認(rèn)的JEV基因特異性引物,采用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)RT-PCR方法對蝙蝠腦組織進(jìn)行JEV特異基因片段檢測。 ②將SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)RT-PCR判定為JEV陽性或可疑為陽性的腦組織上清液接種Vero細(xì)胞逐日觀察細(xì)胞病變,并盲傳3代,繼續(xù)觀察細(xì)胞變化情況。 ③取細(xì)胞液或腦組織上清液腦腔接種1～3天齡的BALB/c乳鼠,觀察乳鼠發(fā)病情況,有可疑發(fā)病者,取腦組織繼續(xù)盲傳3代,如出現(xiàn)明顯發(fā)病者再進(jìn)行SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)RT-PCR鑒定。 4.細(xì)胞培養(yǎng) 將腦組織研磨液上清用每ml含有100單位青霉素和硫酸鏈霉素的Hanks緩沖溶液1:10稀釋,將已培養(yǎng)好長成單層的Vero細(xì)胞棄去原培養(yǎng)基,加入稀釋好的接種液置于37℃、5%CO_2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)吸附2 h,然后棄去吸附液,加入含2%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(Vero細(xì)胞)繼續(xù)培養(yǎng)。觀察細(xì)胞變化,根據(jù)細(xì)胞是否發(fā)生病變(cytopathiceffect.CPF)判斷病毒培養(yǎng)陰性或者陽性,若細(xì)胞形態(tài)有明顯變化,如細(xì)胞圓縮、顆粒增多、融合成片或碎裂死亡判斷為陽性,陽性者做進(jìn)一步培養(yǎng)分離及分子生物學(xué)檢測;若沒有細(xì)胞形態(tài)變化做RT-PCR檢測是否有病毒增殖,連續(xù)盲傳三代,若仍未有形態(tài)變化且RT-PCR產(chǎn)物未擴(kuò)增出目的基因片斷就判斷為陰性。 5.乳鼠接種實(shí)驗(yàn) 將檢測到的陽性樣本離心取上清液,顱內(nèi)接種乳鼠,每只接種0.03 ml。每天觀察2～3次,連續(xù)觀察1周。接種后48h內(nèi)死亡的乳鼠棄去,視為非特異死亡。乳鼠發(fā)病癥狀為:拒乳、抽搐、側(cè)臥、弓背、直至死亡。若觀察1周后無癥狀出現(xiàn),則連續(xù)盲傳,若盲傳三代,仍未出現(xiàn)發(fā)病癥狀,且經(jīng)RT-PCR檢測未擴(kuò)增出目的基因片斷則判斷為陰性。 6.測序和基因分析 ①對RT-PCR擴(kuò)增獲得的目的基因進(jìn)行測序; ②測序結(jié)果利用GeneBank的BLAST軟件進(jìn)行在線同源性分析; ③在GeneBank下載其他JEV序列,利用Clustal W進(jìn)行多序列比對分析; ④用MEGA4.0軟件,采用Neighbor-Joining法,Jukes-Cantor模型做進(jìn)化樹分析。 結(jié)果 1.標(biāo)本收集情況 從2007年至2008年期間共4次到湖南部分地區(qū)收集蝙蝠。共收集了851只,屬于2個(gè)科8個(gè)種。2個(gè)科分別為菊頭蝠科(Rhinolophidae)和蝙蝠科(Vespertilionidae);8個(gè)種分別為:中菊頭蝠(Rhinolophus affinis)496只、大耳菊頭蝠(Rhinolophus macrotis)7只、中華菊頭蝠(Rhinolophus sinicus)20只、大足鼠耳蝠(Myotis ricketti)12只、皮氏菊頭蝠(Rhinolophus pearsoni)2只、小菊頭蝠(Rhinolophus blythi)4只、普通長翼蝠(Miniopterus schreibersi)293只、馬鐵菊頭蝠(Rhinolophus ferrumequinum)17只。 2.RT-PCR檢測結(jié)果 用RT-PCR方法從2007年所采集344份蝙蝠腦組織標(biāo)本中檢測出2份JEV陽性標(biāo)本,分別來自湖南YY地區(qū)和SY地區(qū),YY地區(qū)蝙蝠JEV的攜帶率為0.69%(1/144),SY地區(qū)蝙蝠JEV的攜帶率為0.50%(1/200)。 3.SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)RT-PCR檢測結(jié)果 用SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)RT-PCR方法從2008年所采集507份蝙蝠腦組織標(biāo)本中檢測到弱陽性10例,其中湖南YY地區(qū)4例和SY地區(qū)6例,YY地區(qū)蝙蝠JEV的攜帶率為2.67%(4/150),SY地區(qū)蝙蝠JEV的攜帶率為1.68%(6/357)。 4.細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果 用細(xì)胞培養(yǎng)分離方法對12份陽性標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng),從2007年樣本的2例陽性樣本中觀察到Vero細(xì)胞明顯病變結(jié)果,對2008年的10份陽性樣本進(jìn)行分離培養(yǎng)也觀察到較明顯的病變結(jié)果。 5.乳鼠致病性 乳鼠接種實(shí)驗(yàn)對12份陽性標(biāo)本進(jìn)行鑒定,其中2007年的2例陽性樣本接種乳鼠在第五天出現(xiàn)明顯的抽搐、側(cè)臥、弓背癥狀;2008年的3例陽性樣本接種乳鼠僅出現(xiàn)輕微的抽搐、側(cè)臥、弓背癥狀的癥狀,另7例陽性樣本接種乳鼠未出現(xiàn)明顯癥狀。 6.測序結(jié)果 本次所檢測的蝙蝠JEV分別與NAKAYAMA株、Nakayama-NIH株、YNDL04-45株成一個(gè)分支,都屬于乙腦病毒基因型Ⅲ型。 結(jié)論 本研究表明棲息于湖南地區(qū)的蝙蝠攜帶JEV,但攜帶率不高:2007年收集的標(biāo)本中,YY地區(qū)蝙蝠JEV的攜帶率為0.69%,SY地區(qū)攜帶率為0.50%;2008年收集的標(biāo)本中,YY地區(qū)蝙蝠JEV攜帶率為2.67%,SY地區(qū)攜帶率為1.68%。對從2007年樣本中所檢測出的2份乙腦病毒陽性樣本進(jìn)行測序以及基因序列分析,序列與NAKAYAMA株、Nakayama-NIH株、YNDL04-45株序列同源性為96%～100%。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R181.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2369925