本文選題：女性 + 高危��； 參考：《中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)》2007年博士論文

【摘要】： 生殖道沙眼衣原體(CT)感染是全球最常見的性傳播疾病之一。近五年來(lái)，在北美、歐洲、東南亞的多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，CT感染已上升為所有報(bào)告性病的首位。沙眼衣原體侵入人體后，能誘導(dǎo)產(chǎn)生型特異性細(xì)胞免疫和體液免疫。但通常免疫力不強(qiáng)，，且維持短暫，因而常造成持續(xù)感染、隱性感染和反復(fù)感染。CT感染后，會(huì)出現(xiàn)一系列的臨床疾病，例如在男性患者中可出現(xiàn)非淋菌性尿道炎、淋病后尿道炎、附睪炎、前列腺炎等；在女性中會(huì)出現(xiàn)子宮頸炎、尿道炎、盆腔炎。此外，由于孕婦感染者可通過(guò)產(chǎn)道將沙眼衣原體傳播給新生兒，可導(dǎo)致新生兒結(jié)膜炎和新生兒肺炎等嚴(yán)重感染。沙眼衣原體感染如不能得到及時(shí)診斷和治療，會(huì)產(chǎn)生一系列嚴(yán)重并發(fā)癥，包括輸卵管源性不孕、異位妊娠等。很多研究結(jié)果顯示，大多數(shù)的生殖道CT感染是無(wú)癥狀的隱性感染，或者有一半以上感染者表現(xiàn)為癥狀非常輕微的亞臨床感染，因而往往導(dǎo)致遲發(fā)現(xiàn)、延誤診斷和治療，造成嚴(yán)重后果。根據(jù)世界衛(wèi)生組織和多個(gè)國(guó)家的報(bào)告來(lái)看，CT的發(fā)病率不僅占據(jù)了性病的首位，而且有快速上升的趨勢(shì)。各國(guó)對(duì)性病綜合預(yù)防與控制的干預(yù)策略，并沒(méi)有在CT感染控制方面收到預(yù)期的效果。根據(jù)這些情況，英國(guó)開展了全面的CT篩查項(xiàng)目，我國(guó)周邊的國(guó)家和地區(qū)，例如日本、泰國(guó)、韓國(guó)、印度、中國(guó)臺(tái)灣等都進(jìn)行了以PCR-RFLP外膜蛋白基因分型為基礎(chǔ)的CT感染的分子流行病學(xué)研究，以尋求新的策略和方法。目前我國(guó)的情況是，CT感染在性病監(jiān)測(cè)和上報(bào)系統(tǒng)中尚未作為單獨(dú)的性病進(jìn)行上報(bào)，而是歸類在非淋菌性尿道炎(NGU)中一同上報(bào)，這對(duì)于評(píng)估沙眼衣原體的感染率、發(fā)病率與疾病負(fù)擔(dān)，以及確定控制措施和評(píng)價(jià)干預(yù)效果等帶來(lái)了一定的難度。根據(jù)最近五年的全國(guó)性病疫情分析資料來(lái)看，NGU的發(fā)病率和構(gòu)成比都處于性傳播疾病的首位。說(shuō)明我國(guó)的CT感染流行也面臨著與世界其他國(guó)家和地區(qū)相同的挑戰(zhàn)。然而，在本研究前我國(guó)目前尚缺乏完整的沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)。為此，本研究課題就國(guó)內(nèi)的實(shí)際情況進(jìn)行了如下研究： 第一章沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)的建立和鑒定 通過(guò)與美國(guó)疾病預(yù)防與控制中心性病控制中心合作，以及由中國(guó)性病控制中心購(gòu)買等途徑，獲得了沙眼衣原體15種基本血清型的標(biāo)準(zhǔn)菌株。根據(jù)沙眼衣原體缺乏ATP酶，其所需能量只能依靠其他細(xì)胞提供，其為嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生的原核細(xì)胞型微生物這一特性，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況和條件，使用McCoy細(xì)胞作為標(biāo)準(zhǔn)菌株體外培養(yǎng)的載體細(xì)胞，使用含10％小牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行了McCoy細(xì)胞的培養(yǎng)、含1‰放線菌酮的沙眼衣原體培養(yǎng)液進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌株的接種、培養(yǎng)和傳代、進(jìn)行了碘染色觀察細(xì)胞內(nèi)沙眼衣原體包涵體。并且通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物和巢式PCR引物擴(kuò)增外膜蛋白基因、限制性內(nèi)切酶酶切、垂直電泳等實(shí)驗(yàn)鑒定各型沙眼衣原體標(biāo)準(zhǔn)菌株，從而在國(guó)內(nèi)建立了較為完整的沙眼衣原體基本血清型標(biāo)準(zhǔn)菌株庫(kù)。 第二章沙眼衣原體質(zhì)粒擴(kuò)增和檢測(cè)方法的建立 在絕大多數(shù)沙眼衣原體中普遍存在著一種隱性質(zhì)粒(cryptic plasmid)，這種質(zhì)粒DNA約為7.5kb，基因序列非常保守，各型之間變異不到1％。在質(zhì)粒DNA上有8個(gè)開放讀碼框(open reading frames，ORV)，其中有5個(gè)ORF是有功能的。在ORF1和ORF8之間有一個(gè)高度保守的22kb的連續(xù)重復(fù)4次的核苷酸序列，CT質(zhì)粒DNA單向復(fù)制的起點(diǎn)就在這段重復(fù)序列的附近。在每個(gè)沙眼衣原體菌體中的質(zhì)粒DNA有7～10個(gè)拷貝數(shù)，而沙眼衣原體主外膜蛋白基因(ompl)只有1個(gè)拷貝數(shù)。因此，即便在CT的濃度非常低的情況下，也可以較為敏感的擴(kuò)增出質(zhì)粒DNA，以滿足檢測(cè)要求。因此針對(duì)沙眼衣原體隱性質(zhì)粒的基因片段進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和檢測(cè)是在ompl基因分型研究之前，確定標(biāo)本中是否存在沙眼衣原體的最佳方法之一。本研究根據(jù)Bass 1993年的研究，結(jié)合羅氏Amplicor CT／NG(?)檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明，設(shè)計(jì)了CP24和CP27兩條針對(duì)沙眼衣原體質(zhì)粒的引物，并且通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床標(biāo)本的試驗(yàn)，成功擴(kuò)增出207kb的目的片段。 第三章沙眼衣原體主要外膜蛋白基因(ompl)巢式PCR擴(kuò)增和RFLP檢測(cè)方法的建立 主要外膜蛋白(又稱主外膜蛋白)是沙眼衣原體外膜蛋白的主要成分，分子質(zhì)量占外膜蛋白的60％，主外膜蛋白有4個(gè)可變區(qū)(VD)和5個(gè)恒定區(qū)(CD)。針對(duì)主外膜蛋白的單克隆抗體和多克隆抗體檢測(cè)方法，將CT分為15個(gè)血清型，主外膜蛋白的VD區(qū)氨基酸序列的變化由主外膜蛋白基因(ompl)決定。CT各型的ompl基因總長(zhǎng)度約為1.1kb左右，各型的長(zhǎng)度略有不同�；趏mpl基因的PCR-RFLP技術(shù)和基因測(cè)序等都能便捷的進(jìn)行大規(guī)模樣本的CT基因分型的流行病學(xué)研究。因此利用ompl基因DNA分型方法，可描述不同型的CT感染在人群、時(shí)間和地域上的分布情況。由于ompl基因在CT中是單份拷貝的，相比較質(zhì)粒PCR擴(kuò)增而言，擴(kuò)增難度更大。因此需要敏感性較高的擴(kuò)增和檢測(cè)技術(shù)。本章主要內(nèi)容是針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床標(biāo)本進(jìn)行基于ompl基因PCR擴(kuò)增的DNA提取方法的優(yōu)化選擇、初步PCR和巢式PCR引物設(shè)計(jì)及篩選、反應(yīng)體系的建立和反應(yīng)條件的優(yōu)化。目的在于提高CT感染標(biāo)本ompl的擴(kuò)增敏感性。同時(shí)，本課題使用標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒PCR的反應(yīng)體系及ompl基因的反應(yīng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增，并且取得很好的效果，由此在每步PCR擴(kuò)增反應(yīng)中將標(biāo)準(zhǔn)菌株質(zhì)粒PCR設(shè)立為陽(yáng)性對(duì)照。 第四章基于沙眼衣原體基因分型方法的性病淋巴肉芽腫臨床病例的診斷 對(duì)一例具有性病淋巴肉芽腫(lymphogranuloma venereum，LGV)臨床特點(diǎn)的患者進(jìn)行臨床資料的綜合分析，包括淋巴結(jié)活檢、陰道鏡檢查、Clearview衣原體快速檢測(cè)，并通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增沙眼衣原體主要外膜蛋白o(hù)mpl的基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行AluⅠ酶切，限制性內(nèi)切酶多態(tài)性(RFLP)對(duì)沙眼衣原體分型，并對(duì)ompl基因的恒定區(qū)CD3、CD5，以及可變區(qū)VD4進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、擴(kuò)增并測(cè)序，對(duì)感染株進(jìn)行分型，確定為L(zhǎng)3型沙眼衣原體感染。 第五章沙眼衣原體基因分型的臨床流行病學(xué)研究 通過(guò)針對(duì)ompl基因PCR-RFLP分型的方法研究國(guó)內(nèi)女性高危人群生殖道CT感染的基因型分布。研究人群包括了性病門診女性患者和女性工作者(包括羈押和娛樂(lè)場(chǎng)所的性工作者)，研究地點(diǎn)分布在中國(guó)南部的深圳和廣州、東部的上海和南京、西南部的成都和南寧六個(gè)城市。為了研究男性和女性人群中的衣原體基因型分布差異，在南寧的性病門診收集女性宮頸標(biāo)本的同時(shí)收集了324份男性尿道拭子標(biāo)本，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)男性和女性CT感染者中基因型分布的差別。在收集的1770例女性宮頸拭子標(biāo)本中，共檢測(cè)出質(zhì)粒陽(yáng)性標(biāo)本240例，其中226例標(biāo)本的ompl基因成功擴(kuò)增。在分型結(jié)果中，血清型E(n=63，27.9％)、F(n=53，23.5％)、G(n=28，12.4％)和D(n=25，11.1％)最為流行。F型感染與小年齡組和單身婚姻狀況的相關(guān)性有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。G型與下腹痛關(guān)系密切，47.5％的E型感染者為無(wú)癥狀感染。這些研究結(jié)果提供了國(guó)內(nèi)高危女性人群中CT感染型別分布的基本情況，同時(shí)結(jié)果也表明包括無(wú)癥狀感染在內(nèi)的這些高危女性人群面臨多種型別衣原體感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。盡管樣本量有限，但是衣原體型別和臨床表現(xiàn)之間的關(guān)系也能幫助提供相應(yīng)的信息。
[Abstract]:CT infection is one of the most common sexually transmitted diseases in the world . CT infection has risen to the top of all reported diseases in recent five years .
According to the report of the World Health Organization ( WHO ) and several countries , the incidence and composition ratio of NGU has not only occupied the first place of sexually transmitted diseases , but also has the same challenges as other countries and regions of the world .


Chapter 1 Establishment and identification of the standard strain library of Chlamydia Chlamydia


In this paper , the standard strain of 15 essential serotypes of Chlamydia trachoma was obtained by cooperating with STD control center of Centers for Disease Prevention and Control of the United States , and purchased by China STD Control Center . According to the actual conditions and conditions of the laboratory , we used McCoy cells as the carrier cells cultured in vitro by using McCoy cells as standard strains .


Chapter II Establishment of Plasmid Amplification and Detection Methods for Chlamydia Tracts


A recessive plasmid was found in the majority of Chlamydia . The plasmid DNA was about 7.5 kb and the gene sequence was very conserved . There were 8 open reading frames ( ORV ) in the plasmid DNA . There were 8 open reading frames ( ORV ) in the plasmid DNA .


The Establishment of the Nested PCR Amplification and RFLP Detection Method for the Main Outer Membrane Protein Gene ( ompl ) of Chlamydia Tracts in Chapter 3


The PCR - RFLP technique and gene sequencing of ompl gene were used to study the distribution of CT gene typing of large - scale samples .


Chapter IV Diagnosis of clinical cases of lymphogranuloma of sexually transmitted disease based on the genotyping method of Chlamydia .


A comprehensive analysis of clinical data of patients with lymphogranuloma venereum ( LGV ) was carried out , including lymph node biopsy , vaginal speculum examination , rapid detection of Clearview Chlamydia , and amplification of the gene of the main outer membrane protein ompl of Chlamydia . The amplification products were amplified and sequenced by restriction endonuclease polymorphism ( RFLP ) , and the infected strains were genotyped and determined to be L3 - type chlamydia infection .


A clinical epidemiological study on the gene typing of Chlamydia Chlamydia in the fifth chapter


The genotype distribution of genital tract CT infection in female high - risk population was studied by PCR - RFLP method for ompl gene . The study population included 240 cases of female patients and female workers ( including sex workers in detention and recreation areas ) in southern China .
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R181.3;R518

【參考文獻(xiàn)】

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1 孟慶聯(lián),張奇玉,齊青山;139例軟下疳、性病性淋巴肉芽腫疑似病例調(diào)查分析[J];安徽預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

2 鄧超群,賀新國(guó);性病性淋巴肉芽腫1例[J];中國(guó)皮膚性病學(xué)雜志;2002年01期

3 鐘曉云,余加林,謝勇,鄧兵,張渝,劉官信,李宜;裂解酶片段長(zhǎng)度多態(tài)性在沙眼衣原體主要外膜蛋白基因分型中的應(yīng)用研究[J];中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2005年07期

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本文編號(hào)：1936303