本文關(guān)鍵詞：p75NTR在大鼠頜突外胚間充質(zhì)干細胞體外礦化過程中表達變化的研究

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【摘要】：研究背景牙齒缺失幾乎是每個人一生當(dāng)中必須面對的問題,特別是社會逐步進入人口老齡化的今天,這一問題尤為普遍,對人類健康的危害和生活質(zhì)量的影響也越來越突出。目前臨床上解決這一問題的主要手段是義齒,但無論是在功能還是感覺上,都無法與天然牙相比。因此需要一種與天然牙具有最為相似或者完全相同功能的修復(fù)體,無疑組織工程化牙齒是較為理想的選擇,但由于牙齒發(fā)育的確切機制尚未明確,制約了組織工程化牙齒的發(fā)展進程。而模擬牙發(fā)育外胚間充質(zhì)-上皮作用理論的細胞重聚技術(shù)為組織工程化牙齒發(fā)展注入新的理念,作為牙源性干細胞的始祖細胞——顱神經(jīng)嵴來源的EMSCs是細胞重聚技術(shù)獲得再生牙最為理想的種子細胞。但當(dāng)前對顱神經(jīng)嵴來源的EMSCs的體外分化命運及影響因素了解還遠遠不夠。因此,通過探討不同胚齡EMSCs的礦化能力,了解其體外分化命運,有助于推進組織工程牙齒的發(fā)展進程,同時為組織工程化牙齒探尋良好的種子細胞。p75神經(jīng)營養(yǎng)受體(p75 neurotrophin receptor,p75NTR)作為神經(jīng)營養(yǎng)因子的低親和力受體,主要表達在神經(jīng)細胞的早期發(fā)育中,被認為是顱神經(jīng)嵴的經(jīng)典標志物,參與細胞的生存、增殖、遷移、分化和凋亡等多重生物學(xué)效應(yīng)。目前,p75NTR在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和再生中的調(diào)控作用已得到較充分闡述,但是參與神經(jīng)系統(tǒng)以外組織(如脂肪、肝臟、肌肉、牙齒等)形態(tài)發(fā)生的研究尚處于起步階段,特別是在牙齒發(fā)育過程中的作用鮮有報道。本課題組前期的研究已證實,顱神經(jīng)嵴細胞于大鼠E11.5d遷移至頜突組織,E12.5d牙發(fā)育尚未啟動。本實驗在以往研究的基礎(chǔ)上進一步通過比較p75NTR在不同胚齡大鼠頜突EMSCs體外礦化過程中的表達變化,初步探討p75NTR在頜突EMSCs礦化過程中的作用,為揭示牙齒發(fā)育的分子生物學(xué)機制提供實驗基礎(chǔ)。研究內(nèi)容1.HE染色觀察不同胚齡大鼠牙胚的形態(tài)觀察受孕12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40mg/kg),等待5-10min左右,行腹腔手術(shù)取出胚胎,4%多聚甲醛固定24h,包埋,按矢狀面方向切片,厚度為8μm,HE染色,顯微鏡下觀察、拍照。2.E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d SD大鼠頜突EMSCs的體外培養(yǎng)及鑒定受孕E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40mg/kg),等待5-10min左右,行腹腔手術(shù),無菌條件下取出胎鼠,切取頜突,切成0.1mm*0.1mm*0.1mm的組織塊,胰酶消化、離心,經(jīng)不銹鋼篩網(wǎng)過濾后分別加入含100ml/L胎牛血清的培養(yǎng)基,置于5%CO2 37℃孵育箱中培養(yǎng)。分別從細胞形態(tài)、細胞增殖能力、細胞免疫熒光、流式細胞技術(shù)檢測細胞表面抗原對E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5d EMSCs進行生物學(xué)鑒定。3.E12.5d、E13.5d、E15.5d和18.5d EMSCs體外礦化誘導(dǎo)分別對E12.5d、13.5d、15.5d和18.5d頜突EMSCs進行礦化誘導(dǎo),于誘導(dǎo)0d、7d、14d、21d后分別觀察細胞形態(tài)、ALP活性、礦化能力、礦化相關(guān)基因蛋白以及p75NTR的表達變化。結(jié)果1.E12.5d大鼠牙胚處于牙板形成期,口腔上皮向組織內(nèi)部生長形成的一種上皮性結(jié)構(gòu);E13.5 d進入牙胚發(fā)育的蕾狀期,此時牙胚的牙板末端膨大,上皮細胞增生形成卵圓形或圓形的上皮芽,形似花蕾。E15.5 d大鼠牙胚的上皮芽繼續(xù)生長、增大,長入上皮基底部向內(nèi)凹陷形似帽子,覆蓋在外胚間葉細胞聚集區(qū),稱為帽狀期,成釉器分為三層細胞:即外釉上皮層、星網(wǎng)狀層和內(nèi)釉上皮層。其中成釉器下方的細胞聚集區(qū)稱為牙乳頭,形成牙本質(zhì)和牙髓,包繞成釉器和牙乳頭的外胚間葉細胞稱為牙囊,形成牙支持組織。E18.5 d大鼠牙胚發(fā)育進入鐘狀期,上皮凹陷加深,周緣繼續(xù)生長,形似吊鐘,此時成釉器進入成熟期,分為4層細胞即外釉上皮層、星網(wǎng)狀層、中間層和內(nèi)釉上皮層,內(nèi)釉上皮與外釉上皮相連處稱為頸環(huán)。2.(1)體外分離、培養(yǎng)的E12.5d、E13.5d、E15.5d、E18.5d EMSCs均為長梭型的成纖維樣細胞,胞體豐滿,細胞增殖能力強。(2)流式細胞檢測:E12.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表達率分別為:92.93%、98.39%、95.49%、92.86%、91.44%、22.53%,E13.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表達率分別為:97.01%、96.64%、97.70%、98.26%、97.15%、82.42%,E15.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表達率分別為:95.65%、98.50%、98.49%、97.90%、99.51%、85.09%,E18.5d EMSCs的CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR表達率分別為:95.79%、96.97%、91.28%、97.92%、96.83%、81.43%,CD45在E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d EMSCs表達率分別為:5.78%、5.24%、8.34%、8.51%。E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d頜突EMSCs均陽性表達CD14、CD29、CD90、CD146、CD166、p75NTR,陰性表達CD45。3.(1)堿性磷酸酶染色結(jié)果:礦化誘導(dǎo)7d后,各實驗組染色較對照組深,E18.5d EMSCs實驗組染色最深。(2)茜素紅染色結(jié)果:礦化誘導(dǎo)21天后,各組均有礦化結(jié)節(jié)形成,其結(jié)果與ALP染色結(jié)果一致,即E18.5d EMSCs實驗組礦化結(jié)節(jié)形成量最多。(3)RT-PCR結(jié)果:礦化誘導(dǎo)7天后,各組提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄后進行PCR反應(yīng),各實驗組ALP表達水平明顯高于對照組,其中E18.5d EMSCs表達較高(P㩳0.05);礦化誘導(dǎo)14d后,各實驗組礦化相關(guān)基因Runx2、Col I以及p75NTR m RNA表達高于對照組,在E18.5d EMSCs實驗組表達較高(P㩳0.05);對照組p75NTR的表達未見明顯變化。(4)Western blot結(jié)果:礦化誘導(dǎo)14d,礦化相關(guān)蛋白Runx2、Col I表達量在E18.5d EMSCs實驗組較高,蛋白灰度值檢測其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05);礦化前期各組p75NTR蛋白未見明顯變化,而21d后各實驗組明顯高于對照組,蛋白灰度值檢測其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P㩳0.05),各對照組間未見明顯變化。結(jié)論通過不同胚齡頜突外胚間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)、生物學(xué)鑒定和體外礦化誘導(dǎo),以及對礦化相關(guān)基因蛋白的檢測,發(fā)現(xiàn)E12.5d、E13.5d、E15.5d和E18.5d EMSCs均為顱神經(jīng)嵴源性的間充質(zhì)干細胞,其中E18.5d EMSCs增殖能力和礦化能力強,這說明E18.5d EMSCs是未來研究牙組織工程較為理想的種子細胞;流式檢測發(fā)現(xiàn)p75NTR在E13.5d表達顯著升高,并保持高表達,以及p75NTR在礦化誘導(dǎo)后表達明顯升高,推測p75NTR可能參與成牙初期牙齒的發(fā)育。
【關(guān)鍵詞】：頜突 外胚間充質(zhì)干細胞 神經(jīng)營養(yǎng)受體 礦化
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 不同胚齡大鼠牙胚形態(tài)觀察14-18
• 2.1 材料與方法14-16
• 2.2 結(jié)果16-17
• 2.3 討論17-18
• 第三章 不同胚齡頜突外胚間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)及生物學(xué)鑒定18-26
• 3.1 材料與方法18-21
• 3.2 結(jié)果21-25
• 3.3 討論25-26
• 第四章 不同胚齡頜突外胚間充質(zhì)干細胞體外礦化能力的研究26-37
• 4.1 材料與方法26-34
• 4.2 結(jié)果34-36
• 4.3 討論36-37
• 全文小結(jié)37-38
• 參考文獻38-41
• 文獻綜述 p75神經(jīng)營養(yǎng)受體的研究進展41-51
• 參考文獻47-51
• 碩士在讀期間發(fā)表文章51-52
• 致謝52

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本文編號：995136