本文關(guān)鍵詞：復(fù)合基因納米纖維支架促進(jìn)骨再生的研究

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【摘要】：近年來，隨著組織工程的發(fā)展需要，各種滿足不同要求的生物醫(yī)用支架材料得到了廣泛研究。利用生物醫(yī)用材料治療骨組織缺損成為骨組織修復(fù)的一個(gè)新選擇。 通過靜電紡絲法制備的納米纖維支架直徑為納米級(jí)，比表面積大，因而具有獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)。另外由于結(jié)構(gòu)類似于天然細(xì)胞外基質(zhì)，有利于細(xì)胞黏附，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖及分化[1]，使該方法成為制備組織工程支架材料的最佳選擇之一。但是，現(xiàn)階段研究顯示：體內(nèi)局部細(xì)胞不足，單純的納米纖維支架促進(jìn)骨形成的能力有限[14]。因此，需要生長(zhǎng)因子或細(xì)胞與納米纖維支架復(fù)合發(fā)揮骨誘導(dǎo)作用，外源細(xì)胞引入具有引起機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)及細(xì)胞不能成活等缺點(diǎn)。 骨形成蛋白2（Bone morphogenetic protein-2,BMP2）是公認(rèn)的促進(jìn)骨再生的生長(zhǎng)因子。促紅細(xì)胞生成素（Erythropoietin,EPO）可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial progenitor cells, EPCs)遷移、促進(jìn)培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞趨化，促進(jìn)局部血管的形成，，為骨再生提供良好的微環(huán)境[2,3]。然而，蛋白類生長(zhǎng)因子部分造價(jià)較高以及具有免疫原性，較難得到廣泛應(yīng)用。因此，可以應(yīng)用負(fù)載生長(zhǎng)因子基因的載體，通過轉(zhuǎn)染自體細(xì)胞原位表達(dá)相應(yīng)生長(zhǎng)因子以達(dá)到治療目標(biāo)。但是，單純?cè)诠侨睋p處應(yīng)用病毒不僅會(huì)使病毒隨體液擴(kuò)散，降低病毒濃度，還有可能造成異位感染[4]。目前的解決方法是利用生物材料將病毒固定于應(yīng)用部位。例如[5]：將病毒混入靜電紡絲溶液中，通過高壓靜電紡絲裝置將病毒與納米纖維共紡。其缺點(diǎn)在于高壓及有機(jī)溶劑會(huì)降低病毒活力且病毒不易定量。這為腺病毒在體內(nèi)應(yīng)用促進(jìn)骨缺損修復(fù)造成了困難。因此，我們通過制備聚乳酸-羥基乙酸納米纖維支架，利用蔗糖作為冷凍保護(hù)劑，采用冷凍干燥法將聚乳酸羥基乙酸共聚物（PLGA）與腺病毒復(fù)合。通過掃描電子顯微鏡觀察PLGA納米纖維支架的表面形貌，通過DNA定量試劑盒檢測(cè)腺病毒在PLGA納米纖維支架上的釋放動(dòng)力學(xué)；通過編碼綠色熒光蛋白（EGFP）基因的腺病毒Ad-EGFP感染骨髓基質(zhì)細(xì)胞（Bone marrow stroma cell, BMSCs）使細(xì)胞表達(dá)EGFP在體外檢測(cè)PLGA/腺病毒復(fù)合納米纖維支架上病毒的活力。通過Real-time PCR和茜素紅染色檢測(cè)編碼BMP2基因的腺病毒Ad-BMP2對(duì)大鼠BMSCs成骨向分化及鈣結(jié)節(jié)形成的影響。另外，我們將載EPO基因和BMP2基因的納米纖維支架植入大鼠顱骨缺損動(dòng)物模型，通過Micro-CT和組織學(xué)分析檢測(cè)其體內(nèi)成骨能力。通過上述實(shí)驗(yàn)的一些初步成果顯示，通過靜電紡絲方法制備的PLGA納米纖維支架纖維交錯(cuò)，纖維表面平滑，孔隙率較高；腺病毒在PLGA表面釋放為突釋曲線；此外，冷凍干燥法能夠局部提高病毒濃度，在體外能夠促進(jìn)Ad-EGFP感染BMMSCs表達(dá)EGFP，Ad-BMP2能夠明顯增強(qiáng)BMSCs向成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)其鈣結(jié)節(jié)形成。在體內(nèi)能夠在顱骨缺損局部原位表達(dá)EPO及BMP2，增加血管形成，為骨再生提供一個(gè)良好的微環(huán)境。 綜上，PLGA/Ad納米纖維支架能夠良好的保留腺病毒活性，具有良好的促進(jìn)體內(nèi)外新骨組織形成的能力，因此，它作為一種新形式的病毒材料復(fù)合物可能為骨組織工程領(lǐng)域中生物醫(yī)用材料的應(yīng)用提供一個(gè)新的選擇。
【關(guān)鍵詞】：BMP2 EPO 骨再生 納米纖維 腺病毒
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R783.1
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-12
• 第1章 文獻(xiàn)綜述12-15
• 1.1 骨組織工程12-14
• 1.1.1 納米纖維支架12
• 1.1.2 種子細(xì)胞12-13
• 1.1.3 生長(zhǎng)因子13-14
• 1.2 載病毒的納米材料在骨組織工程中的應(yīng)用14-15
• 第2章 納米支架材料的合成和表征15-20
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器15
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法15-17
• 2.2.1 納米纖維支架的制備和形貌觀察15-16
• 2.2.2 腺病毒/蔗糖溶液的制備16
• 2.2.3 PLGA 與腺病毒的復(fù)合16
• 2.2.4 載基因支架材料體外控釋實(shí)驗(yàn)16-17
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-18
• 2.3.1 納米纖維支架的掃描電鏡結(jié)果17
• 2.3.2 體外病毒釋放結(jié)果17-18
• 2.4 討論18-20
• 第3章 納米纖維支架復(fù)合腺病毒對(duì)腺病毒活性的影響20-23
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器20
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法20-21
• 3.2.1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的提取與培養(yǎng)20-21
• 3.2.3 PLGA/Ad-EGFP 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的感染活性21
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果21-22
• 3.3.1 PLGA/Ad-EGFP 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的感染情況21-22
• 3.4 討論22-23
• 第4章 載 BMP2 的納米纖維支架在體內(nèi)外促進(jìn)骨組織再生的實(shí)驗(yàn)研究23-32
• 4.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器23
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法23-28
• 4.2.1 ELISA 檢測(cè) Ad-BMP2 感染 BMSCs 后 BMP2 的分泌情況23-24
• 4.2.2 Ad-BMP2 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨向分化的影響24-26
• 4.2.3 茜素紅染色26-27
• 4.2.4 建立大鼠顱骨缺損動(dòng)物模型27
• 4.2.5 新生骨量檢測(cè)27
• 4.2.6 組織學(xué)分析27
• 4.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析27-28
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果28-30
• 4.3.1 Ad-BMP2 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的影響28
• 4.3.2 Ad-BMP2 對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨向分化的影響28-29
• 4.3.3 茜素紅染色檢測(cè) Ad-BMP2 感染 BMSCs 后細(xì)胞的礦化能力29
• 4.3.4 MicroCT 檢測(cè)大鼠顱骨缺損部位的修復(fù)情況29-30
• 4.3.5 HE 染色檢測(cè)大鼠顱骨缺損部位的修復(fù)情況30
• 4.4 討論30-32
• 第5章 載 EPO 的納米纖維支架促進(jìn)骨組織再生的體內(nèi)研究32-35
• 5.1 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器32
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法32
• 5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果32-34
• 5.3.1 MicroCT 檢測(cè)大鼠顱骨缺損部位的修復(fù)情況32
• 5.3.2 HE 染色檢測(cè)大鼠顱骨缺損部位的修復(fù)情況32-34
• 5.4 討論34-35
• 第6章 結(jié)論35-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 在學(xué)期間所取得的科研成果40-41
• 后記和致謝41

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