本文關(guān)鍵詞：葛根素作為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療藥物的研究

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【摘要】：牙菌斑微生物是牙周炎的始動因子,然而在菌斑普遍存在的情況下,只有約小于20%的人發(fā)展為重度牙周炎。牙周炎在不同的個體發(fā)生和發(fā)展的差異性,提示宿主因素在牙周炎發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重大作用。臨床上也可以看到傳統(tǒng)牙周治療對部分牙周炎患者效果有限,在此基礎(chǔ)上,學(xué)者們提出將宿主調(diào)節(jié)治療(host modulatory therapies,HMT)作為傳統(tǒng)牙周炎抗菌治療的輔助治療手段。宿主免疫炎癥反應(yīng)在對抗細(xì)菌感染時產(chǎn)生的蛋白酶(MMPs等)、致炎細(xì)胞因子(TNF-α, IL-1β等)以及前列腺素(PGE2)等炎癥介質(zhì)是導(dǎo)致牙周組織破壞的主體因素。HMT的目標(biāo)是調(diào)節(jié)宿主免疫炎癥反應(yīng),減少炎癥介質(zhì)對牙周組織的損傷。近期研究顯示HMT作為牙周炎潔治和根面平整(scaling and root planning, SRP)的輔助治療帶來顯著性的附加療效。目前研究的宿主調(diào)節(jié)治療藥物主要包括三類：第一類是蛋白酶抑制劑(antiproteinases),此類藥物通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的產(chǎn)生及活性以減少牙周結(jié)締組織的破壞。第二類是抗炎藥物(anti-inflammatory drugs),此類藥物通過抑制致炎細(xì)胞因子或炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生以減少牙周組織的破壞。第三類是骨保護(hù)劑(bone-sparing drugs),此類藥物通過抑制破骨細(xì)胞產(chǎn)生從而減少牙槽骨吸收。目前關(guān)于牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療的藥物研究有很多,但大部分藥物由于效果有限或者有明顯副作用而未被批準(zhǔn)使用于臨床。葛根素(Puerarin, C21H20O9)是植物葛根中最主要的活性成分之一,屬于異黃酮類。近年來的研究證實(shí)葛根素同時具有抑制MMPs、抗炎、骨保護(hù)等活性且具有較高的生物安全性,提示葛根素可能是牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療的有效藥物。本課題通過絲線結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎模型來觀察葛根素作為宿主調(diào)節(jié)治療藥物是否能減輕牙周炎組織破壞,并從抗基質(zhì)金屬蛋白酶、抗炎以及骨保護(hù)三個方面探討葛根素作為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療藥物的作用機(jī)理。第一部分葛根素作為宿主調(diào)節(jié)治療藥物對實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎的療效實(shí)驗(yàn)?zāi)康模豪媒z線結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎模型來評估葛根素是否能對牙周炎組織破壞起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)材料和方法：將40只雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組,每組8只：健康對照組(CON組)、絲線結(jié)扎組(L組)、葛根素100mg/kg (PR100),200mg/kg(PR200)、 400mg/kg (PR400)劑量組。灌胃法給予三個劑量的葛根素,每天一次；L組只接受藥物溶劑(0.5%CMC)。采用絲線結(jié)扎法建立大鼠雙側(cè)下頜第一磨牙牙周炎模型,在建模第7天處死大鼠。取一側(cè)下頜骨行micro-CT掃描,測量第一磨牙周圍釉牙骨質(zhì)界到牙槽嵴頂距離(CEJ-ABC)以及第一磨牙根間區(qū)骨體積(BV/TV)。取另一側(cè)下頜骨脫鈣制作切片,行HE染色測量骨吸收程度以及炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)目；行天狼猩紅染色進(jìn)行膠原定量分析(A%)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：Micro-CT結(jié)果顯示葛根素減少了牙槽骨吸收程度,PR200和PR400組的CEJ-ABC距離比L組顯著降低；PR200組的骨體積(BV/TV)顯著高于L組。在HE切片上進(jìn)行的骨測量分析結(jié)果與micro-CT法一致,葛根素干預(yù)顯著降低了第一磨牙遠(yuǎn)中牙間區(qū)CEJ-ABC距離以及第一磨牙根間區(qū)骨吸收面積；同時葛根素顯著減少了牙周組織中炎癥細(xì)胞數(shù)目。葛根素干預(yù)組(PR200)膠原纖維A%顯著高于L組。結(jié)論：葛根素能夠減少絲線結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎的牙槽骨吸收、炎癥浸潤以及膠原破壞,可能成為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療的候選藥物。第二部分葛根素作為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療藥物的作用機(jī)制實(shí)驗(yàn)一葛根素抗基質(zhì)金屬蛋白酶的作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模篍MMPRIN是MMPs的誘導(dǎo)因子,其糖基化程度影響MMP-2以及MMP-9的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)檢測了葛根素對牙周炎組織中MMP-2和MMP-9的作用,并檢測了此作用是否通過調(diào)節(jié)EMMPRIN糖基化實(shí)現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)材制和方法：取第一部分實(shí)驗(yàn)中CON組、L組、PR200組中大鼠下頜第一磨牙牙齒周圍齦緣下2mm的牙齦組織,提取蛋白,western blot檢測組織中MMP-2和MMP-9的表達(dá)量,并檢測EMMPRIN糖基化的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：與CON組相比,牙周炎L組的MMP-2與MMP-9表達(dá)量均顯著增多；而葛根素顯著性抑制了二者的增多。EMMPRIN出現(xiàn)在兩個分子帶區(qū)域,分別代表高糖基化形式(HG-EMMPRIN)和低糖基化形式(LG-EMMPRIN),EMMPRIN總表達(dá)量即(HG+LG)-EMMPRIN在三組間無顯著性差異,而高低糖基化的比例即HG/LG-EMMPRIN在三組間分布不同,在L組高糖基化比例顯著增高；與L組相比,葛根素顯著性降低了此比例。結(jié)論：葛根素通過抑制牙齦組織中EMMPRIN糖基化而減少了MMP-2和MMP-9的產(chǎn)生,從而對牙周組織起到保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)二葛根素的抗炎作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康?TNF-a與IL-1β是牙周炎病程中兩個關(guān)鍵性的致炎細(xì)胞因子,受MAPK及NF-κB信號通路調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)從體內(nèi)和體外兩方面檢測葛根素對TNF-α與IL-1β的作用,評估葛根素是否能在牙周炎病程中發(fā)揮抗炎作用。實(shí)驗(yàn)材料和方法：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,對牙齦卟啉單胞菌LPS (Pg-LPS)刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞使用不同濃度的葛根素,realtime-PCR檢測細(xì)胞中TNF-α以及IL-1β mRNA水平的變化；western blot檢測MAPK及NF-κB信號通路的變化。最后在動物標(biāo)本中驗(yàn)證葛根素對TNF-α與IL-1β的作用,western blot檢測第—部分實(shí)驗(yàn)中CON組、L組、PR200組中大鼠牙齦組織中TNF-α、IL-1β的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,葛根素能濃度依賴性的抑制Pg-LPS刺激的RAW264.7巨噬細(xì)胞中TNF-α以及IL-1β mRNA的表達(dá),并能顯著抑制細(xì)胞中p38 MAPK, JNK MAPK的磷酸化以及NF-κB的活化。在動物實(shí)驗(yàn)中,葛根素能顯著性減少絲線結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎組織中TNF-α、IL-1β的表達(dá)。結(jié)論：葛根素能通過阻斷p38 MAPK, JNKMAPK以及NF-κB信號通路來減少致炎細(xì)胞因子TNF-α以及IL-1β的表達(dá),可能能在牙周炎病程中發(fā)揮較好的抗炎效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)三葛根素的骨保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)?zāi)康模篟ANKL/OPG是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化以及骨吸收活性的關(guān)鍵分子。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物實(shí)驗(yàn)兩個方面檢測葛根素對RANKL/OPG的作用,探討其在牙周炎中發(fā)揮骨保護(hù)作用的可能機(jī)制。實(shí)驗(yàn)材料和方法：在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,用不同濃度葛根素(25μM,50μM,100μM,200μM)分別處理PDLCs 1天、2天、3天、4天,realtime-PCR檢測細(xì)胞中RANKL以及OPG mRNA的變化。在動物實(shí)驗(yàn)中,對第一部分實(shí)驗(yàn)中CON組、L組、PR200組切片行免疫組化染色檢測RANKL/OPG的變化,行TRAP染色檢測破骨細(xì)胞的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,葛根素處理1-4天不同時間組的PDLCs中均未檢測到RANKL mRNA的表達(dá)。葛根素處理PDLCs一天后未對細(xì)胞中OPG mRNA產(chǎn)生顯著影響；處理第2天和第3天呈濃度依賴性的增加細(xì)胞中OPG mRNA量；處理第4天四個濃度的葛根素均對細(xì)胞中OPG mRNA呈抑制作用。動物實(shí)驗(yàn)中,免疫組化結(jié)果顯示葛根素對實(shí)驗(yàn)性牙周炎引起的RANKL和OPG表達(dá)增多均呈顯著性抑制作用,但對RANKL的抑制程度更強(qiáng),導(dǎo)致RANKL/OPG比值顯著性降低。葛根素干預(yù)組(PR200)成熟破骨細(xì)胞數(shù)目比L組顯著減少。結(jié)論：葛根素能調(diào)節(jié)牙周細(xì)胞和組織中RANKL和OPG的表達(dá),減少破骨細(xì)胞生成,從而對牙槽骨起到保護(hù)作用。綜上所述,我們通過絲線結(jié)扎誘導(dǎo)的大鼠牙周炎模型證實(shí)了葛根素作為宿主調(diào)節(jié)治療藥物能有效減少牙周炎引起的牙槽骨吸收和結(jié)締組織破壞,這種宿主調(diào)節(jié)的作用機(jī)理來自抗MMPs活性、抗炎、骨保護(hù)三方面。葛根素能通過抑制牙周炎組織中EMMPRIN糖基化來減少M(fèi)MP-2和MMP-9的產(chǎn)生；并能通過阻斷MAPK和NF-κB信號通路減少致炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生；同時葛根素通過降低牙周炎組織中RANKL/OPG比例而減少破骨細(xì)胞生成。
【關(guān)鍵詞】：葛根素 牙周炎 宿主調(diào)節(jié)治療 EMMPRIN MMPs TNF-α IL-1β RANKL OPG
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 中文摘要10-14
• 英文摘要14-19
• 引言19-23
• 文獻(xiàn)綜述23-33
• 實(shí)驗(yàn)研究33-99
• 第一部分 葛根素作為宿主調(diào)節(jié)治療藥物對實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎的療效33-53
• 實(shí)驗(yàn)一 葛根素作為宿主調(diào)節(jié)治療藥物對實(shí)驗(yàn)性大鼠牙周炎的療效34-53
• 第二部分 葛根素作為牙周炎宿主調(diào)節(jié)治療藥物的作用機(jī)制53-99
• 實(shí)驗(yàn)一 葛根素抗基質(zhì)金屬蛋白酶的作用54-64
• 實(shí)驗(yàn)二 葛根素的抗炎作用64-83
• 實(shí)驗(yàn)三 葛根素的骨保護(hù)作用83-99
• 結(jié)論99-100
• 參考文獻(xiàn)100-113
• 個人簡歷113-114
• 致謝114-116
• 附件116-117

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本文編號：994171