本文關(guān)鍵詞：“炎癥”和健康牙周組織來源干細(xì)胞及其細(xì)胞膜片的功能：同一患者配對研究

  更多相關(guān)文章： 間充質(zhì)干細(xì)胞 牙周膜 炎癥 免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞膜片 組織工程

【摘要】：研究背景:近年來研究發(fā)現(xiàn),相對于牙周組織健康牙齒分離而來的干細(xì)胞(H-PDLSCs),牙周炎患牙處炎癥組織中同樣存在干細(xì)胞,即“炎癥”牙周膜干細(xì)胞(I-PDLSCs),且因其來源更加廣泛、倫理學(xué)問題較少、易于患者接受等優(yōu)勢,具有良好的臨床應(yīng)用潛能,有望應(yīng)用于將來的組織工程和再生醫(yī)學(xué)中�？上У氖�,隨著對“炎癥”干細(xì)胞性能研究的深入,部分學(xué)者認(rèn)為,“炎癥”干細(xì)胞具有和健康干細(xì)胞相似的生物學(xué)性能;而另一部分學(xué)者則認(rèn)為,由于體內(nèi)炎癥微環(huán)境的影響,“炎癥”干細(xì)胞的部分生物學(xué)性能(特別是成骨分化和免疫調(diào)節(jié)能力等)明顯受損,進(jìn)而影響其組織再生能力。詳細(xì)對比分析已有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),造成以上爭議的主要原因在于:“炎癥”組和健康組樣本之間存在明顯差異(包括年齡、性別、樣本量、納入排除標(biāo)準(zhǔn)、取材方法等),而這些因素會在一定程度上影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,本研究嘗試從同一患者來源的“炎癥”與健康牙周組織中,同時(shí)分離培養(yǎng)I-PDLSCs和H-PDLSCs,在最大限度避免以上影響因素的前提下,通過配對研究的方式,全面對比兩種來源PDLSCs的生物學(xué)性能,進(jìn)而明確I-PDLSCs在增殖、分化和免疫調(diào)節(jié)能力等方面的變化,為將來的深入研究以及組織再生應(yīng)用提供可靠的依據(jù)。研究方法:1、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs分離培養(yǎng)和鑒定:選取同時(shí)含有最少1顆牙周炎患牙(無任何保留意義)和最少1顆牙周組織健康牙齒(阻生齒或無功能第三磨牙)的患者作為研究對象,拔牙后,從兩種患牙牙根表面,分別刮取“炎癥”牙周膜和健康牙周膜,并采用酶消化法分離培養(yǎng)出I-PDLSCs和H-PDLSCs,共得到6組樣本。然后,檢測兩種PDLSCs的細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)情況以及細(xì)胞增殖、遷移和多向分化能力。2、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)能力分析:從3名無系統(tǒng)性疾病志愿者的新鮮血液中,分別提取外周血單核細(xì)胞(PBMNCs)待用。然后,將I-PDLSCs或H-PDLSCs和PBMNCs按照不同比例混合,共培養(yǎng)一定時(shí)間后,分析兩種PDLSCs對PBMNCs增殖、凋亡和分泌功能的影響。3、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs膜片的功能分析:I-PDLSCs和H-PDLSCs于成膜誘導(dǎo)液中培養(yǎng)10天,待形成細(xì)胞膜片后,一方面,體外評估所形成細(xì)胞膜片的質(zhì)量,包括膜片形態(tài)構(gòu)成和多向分化能力檢測等;另一方面,選取免疫缺陷小鼠作為動物模型,采用異位移植的方法,將兩種PDLSCs膜片分別移植于裸鼠背部皮下組織,8周后取材,進(jìn)一步分析膜片的體內(nèi)骨形成潛能。4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本研究中,每組I-PDLSCs和H-PDLSCs的對比實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個平行組,并求平均值,以減少人為操作可能的誤差。然后,對6組實(shí)驗(yàn)對象所得到的6個平均值,采用配對t檢驗(yàn)的方法(SPSS 18.0軟件),進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中所有計(jì)量資料均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)的形式表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)P值取0.05,即當(dāng)P0.05時(shí),I-PDLSCs和H-PDLSCs之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。.實(shí)驗(yàn)結(jié)果:1、本研究中,每名患者口內(nèi)均可以同時(shí)分離培養(yǎng)出I-PDLSCs和H-PDLSCs,且都陽性表達(dá)波形蛋白(間充質(zhì)細(xì)胞特異性中間絲蛋白)和間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物(STRO-1、CD146、CD105和CD44),而陰性表達(dá)上皮角蛋白(上皮細(xì)胞特異性中間絲蛋白)和造血細(xì)胞表面標(biāo)記物(CD45和CD34)。另外,細(xì)胞生物學(xué)性能對比結(jié)果顯示:盡管兩種PDLSCs的成脂分化能力無明顯差別,但是相對于H-PDLSCs,I-PDLSCs的增殖和遷移能力明顯增強(qiáng),而成骨分化能力明顯受損。2、I-PDLSCs或H-PDLSCs和PBMNCs按照不同比例共培養(yǎng)一定時(shí)間后,PBMNCs增殖結(jié)果顯示,I-PDLSCs和H-PDLSCs均對PBMNCs的增殖率存在影響,且在72小時(shí)時(shí),I-PDLSCs組中PBMNCs的增殖率會明顯高于H-PDLSCs組(P0.05或0.01)。同時(shí),在72小時(shí)時(shí),PBMNCs凋亡檢測顯示,I-PDLSCs促進(jìn)PBMNCs凋亡的能力亦是明顯減弱。另外,在72小時(shí)時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量分析結(jié)果表明,盡管兩組共培養(yǎng)體系中IL-10的表達(dá)并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,但是I-PDLSCs組中IL-2、IFN-γ和TNF-α的含量均明顯高于H-PDLSCs組(P0.05或P0.01)。3、I-PDLSCs和H-PDLSCs成膜誘導(dǎo)10天后,均可以形成典型的細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)。膜片形態(tài)構(gòu)成分析結(jié)果顯示,相比于H-PDLSCs膜片,I-PDLSCs膜片的厚度和活細(xì)胞數(shù)明顯減少(P0.05或0.01),而I-PDLSCs膜片中I型膠原蛋白、骨膜蛋白和整合素β1的表達(dá)水平則較高(相對于膜片中的總蛋白而言)。膜片功能評估,一方面,體外多向分化能力檢測顯示,和細(xì)胞水平對比結(jié)果相似,I-PDLSCs膜片的成骨和成軟骨分化能力明顯減弱。另一方面,膜片體內(nèi)移植后HE染色,進(jìn)一步證實(shí),I-PDLSCs膜片移植物中新骨區(qū)域占總面積的比例,明顯低于H-PDLSCs膜片組(P0.05)。結(jié)論1、細(xì)胞水平、免疫調(diào)節(jié)水平和細(xì)胞膜片水平對比分析結(jié)果表明,盡管I-PDLSCs的體外多向分化能力、免疫調(diào)節(jié)能力以及體內(nèi)骨再生能力均明顯降低,但是其仍然具有一定的間充質(zhì)干細(xì)胞性能,體外/體內(nèi)實(shí)驗(yàn)可以形成典型的礦化結(jié)節(jié)/骨組織,可能成為一種潛在的間充質(zhì)干細(xì)胞來源,應(yīng)用于牙周組織再生治療。另外,I-PDLSCs的性能特點(diǎn),例如明顯增強(qiáng)的增殖和遷移能力,同樣值得進(jìn)一步研究。2、同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs對比分析,為進(jìn)一步探索I-PDLSCs的性能特點(diǎn)和臨床應(yīng)用策略,提供了一種值得借鑒的研究方法。
【關(guān)鍵詞】：間充質(zhì)干細(xì)胞 牙周膜 炎癥 免疫調(diào)節(jié) 細(xì)胞膜片 組織工程
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文獻(xiàn)回顧16-25
• 牙周膜干細(xì)胞的研究進(jìn)展16-20
• 1 牙周膜干細(xì)胞的性能及其影響因素17-18
• 2 牙周膜干細(xì)胞在牙周組織再生中的應(yīng)用18-19
• 3 “炎癥”牙周膜干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和研究進(jìn)展19-20
• 細(xì)胞膜片技術(shù)的研究進(jìn)展20-25
• 1 細(xì)胞膜片技術(shù)的優(yōu)勢20-21
• 2 細(xì)胞膜片的制作方法21
• 3. 細(xì)胞膜片質(zhì)量評估21-23
• 4 細(xì)胞膜片技術(shù)在牙周再生中的應(yīng)用23-25
• 實(shí)驗(yàn)一 同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs的分離培養(yǎng)和鑒定25-46
• 1 材料26-28
• 2 方法28-36
• 3 結(jié)果36-43
• 4 討論43-46
• 實(shí)驗(yàn)二 同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs的免疫調(diào)節(jié)能力分析46-53
• 1 材料46-47
• 2 方法47-49
• 3 結(jié)果49-51
• 4 討論51-53
• 實(shí)驗(yàn)三 同一患者來源I-PDLSCs和H-PDLSCs膜片的功能分析53-66
• 1 材料53-54
• 2 方法54-57
• 3 結(jié)果57-64
• 4 討論64-66
• 小結(jié)66-68
• 參考文獻(xiàn)68-76
• 個人簡歷和研究成果76-77
• 致謝77

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本文編號：986243