發(fā)布時(shí)間：2017-10-04 16:47

  本文關(guān)鍵詞：炎癥狀態(tài)下鋅指蛋白A20對(duì)牙髓干細(xì)胞增殖及分化能力的影響

  更多相關(guān)文章： 鋅指蛋白A20 人牙髓干細(xì)胞 脂多糖 增殖 分化

【摘要】：常見(jiàn)牙病(牙髓炎、根尖周炎)的實(shí)質(zhì)是炎癥,牙髓炎主要繼發(fā)于齲病,致齲微生物及其產(chǎn)物可以通過(guò)暴露的髓腔或者牙本質(zhì)小管間接感染牙髓。由于缺乏自愈能力,感染后的牙髓組織會(huì)引發(fā)炎癥反應(yīng),繼而變性或壞死,導(dǎo)致根尖周炎、牙齒缺失、牙槽骨缺損等繼發(fā)性疾病[1]。因此,設(shè)法增強(qiáng)牙齒及其周圍組織對(duì)炎癥的抵抗力,以及在炎癥狀態(tài)下的修復(fù)能力,對(duì)于牙齒的保存治療具有重要意義。鋅指蛋白A20是一種具有高度生物學(xué)活性的蛋白。作為NF-κB通路中的一個(gè)重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)因子,A20不僅能夠抑制NF-κB的活性,還能阻斷多種炎癥介質(zhì)的釋放,因此在控制炎癥方面有很大的應(yīng)用前景,但其在炎癥性牙病發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸中的作用卻鮮見(jiàn)報(bào)道。人牙髓干細(xì)胞(hDPSCs)被認(rèn)為是來(lái)源于牙髓組織的未分化間充質(zhì)細(xì)胞,具備高度增殖能力、形成細(xì)胞克隆能力及多向分化潛能。DPSCs的發(fā)現(xiàn)讓我們對(duì)牙齒的發(fā)育、再生及其修復(fù)機(jī)制有了進(jìn)一步認(rèn)識(shí),為開(kāi)發(fā)新的牙病治療方法提供了新的思路。本研究擬通過(guò)RNA干擾技術(shù),建立炎癥狀態(tài)下牙髓干細(xì)胞A20基因沉默的細(xì)胞模型,探討a20基因沉默對(duì)hdpscs增殖及分化能力的影響,為探索牙髓炎、根尖周炎的新療法打下理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果如下:1、hdpscs的分離、培養(yǎng)及鑒定臨床上收集15-28歲成人健康完整第三磨牙,用組織塊酶消化法原代培養(yǎng)hdpscs,有限稀釋法挑取單細(xì)胞克隆并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)和鑒定,體外礦化誘導(dǎo)兩周后進(jìn)行茜素紅染色以檢測(cè)細(xì)胞的分化潛能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,成功分離培養(yǎng)出了具有良好的增殖能力及分化潛能的hdpscs。2、炎癥狀態(tài)下hdpscs中a20表達(dá)量的變化通過(guò)脂多糖lps刺激細(xì)胞,模擬體外的炎性環(huán)境,觀察lps刺激下牙髓干細(xì)胞中a20表達(dá)量的變化。用濃度為1ug/ml的lps刺激液培養(yǎng)細(xì)胞,分別在刺激2h、6h、12h、24h、48h、72h后收集細(xì)胞,通過(guò)westernblot技術(shù)檢測(cè)hdpscs中a20的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:在lps刺激2h時(shí),a20的表達(dá)量即迅速增加并一直持續(xù)到48h,在72h時(shí),a20的表達(dá)量已回到基礎(chǔ)水平。由此我們可以得出結(jié)論:在炎癥狀態(tài)下,a20的表達(dá)具有時(shí)效性,即在早期呈現(xiàn)一過(guò)性的高表達(dá)。3、a20基因沉默的hdpscs細(xì)胞模型的建立為了研究lps刺激下,a20基因沉默對(duì)hdpsc增殖及分化的影響,我們采用rna干涉技術(shù)構(gòu)建a20基因沉默的細(xì)胞模型。參考相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)sirna的序列,并委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中,我們對(duì)sirna的轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行了優(yōu)化,確保能夠?qū)崿F(xiàn)最高的轉(zhuǎn)染效率。用對(duì)任何片段都不具有干涉作用的nc-sirna設(shè)為對(duì)照組,采用westernblot技術(shù)驗(yàn)證a20-sirna的干涉效果,結(jié)果顯示a20的表達(dá)水平明顯下降,表明hdpscs中a20基因抑制的細(xì)胞模型的構(gòu)建是成功的。4、炎癥狀態(tài)下a20基因沉默對(duì)hdpscs增殖能力的影響利用lps模擬體外的炎癥環(huán)境,用cck-8試劑盒研究在炎癥狀態(tài)下a20基因沉默對(duì)hdpsc增殖能力的影響。在sirna成功轉(zhuǎn)染hdpscs后,將細(xì)胞種于96孔板中,并加入lps刺激,分別于1、3、5、7天用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度值,判定細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況。結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中hdpsc的生長(zhǎng)狀況受到明顯抑制,與對(duì)照組相比有顯著性差異,表明A20基因沉默能夠顯著降低hDPSCs的增殖能力。5、炎癥狀態(tài)下A20基因沉默對(duì)hDPSCs分化能力的影響將轉(zhuǎn)染過(guò)siRNA的hDPSCs礦化誘導(dǎo)14天后進(jìn)行茜素紅染色,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組礦化結(jié)節(jié)的數(shù)量明顯低于對(duì)照組,對(duì)以上染色結(jié)果進(jìn)行定量分析后的數(shù)據(jù)顯示,該差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。對(duì)牙髓干細(xì)胞分化相關(guān)標(biāo)志物堿性磷酸酶(ALP)的活性檢測(cè)顯示,與對(duì)照組相比,實(shí)驗(yàn)組hDPSCs的ALP活性受到了明顯抑制。接著對(duì)牙髓干細(xì)胞的部分成骨/成牙相關(guān)基因ALP、DSPP、OCN、RUNX2的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),RT-PCR結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組中這些基因的表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組。以上結(jié)果提示:在炎癥狀態(tài)下,A20基因沉默能夠抑制hDPSC的分化能力。本研究通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明,鋅指蛋白A20在人牙髓干細(xì)胞具有一定的基礎(chǔ)表達(dá)水平,炎癥狀態(tài)下,A20的表達(dá)具有時(shí)效性,即在早期呈現(xiàn)一過(guò)性的高表達(dá),而后維持基礎(chǔ)表達(dá)量,以維系hDPSCs的增殖和分化能力。通過(guò)RNA干涉技術(shù)對(duì)hDPSC中A20的表達(dá)進(jìn)行了阻斷,導(dǎo)致其表達(dá)量低于基礎(chǔ)表達(dá)量后,發(fā)現(xiàn)A20基因沉默是hDPSCs對(duì)抗炎癥能力下降的重要原因,具體表現(xiàn)為其增殖能力及分化能力的下降。
【關(guān)鍵詞】：鋅指蛋白A20 人牙髓干細(xì)胞 脂多糖 增殖 分化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-5
• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-13
• 文獻(xiàn)回顧13-22
• 第一部分 人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定22-29
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-23
• 2 實(shí)驗(yàn)方法23-25
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果25-27
• 4 討論27-29
• 第二部分 炎癥狀態(tài)下HDPSCS中A20表達(dá)量的變化29-37
• 1 實(shí)驗(yàn)材料29-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-34
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果34-35
• 4 討論35-37
• 第三部分 炎癥狀態(tài)下HDPSCS中A20基因沉默的細(xì)胞模型的建立37-45
• 1 實(shí)驗(yàn)材料37-39
• 2 實(shí)驗(yàn)方法39-40
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果40-43
• 4 討論43-45
• 第四部分 炎癥狀態(tài)下A20基因沉默對(duì)HDPSCS增殖及分化能力的影響45-56
• 1 實(shí)驗(yàn)材料45-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-50
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-53
• 4 討論53-56
• 小結(jié)56-58
• 參考文獻(xiàn)58-66
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果66-67
• 致謝67

，

本文編號(hào)：971768