本文關(guān)鍵詞：P75NTR對(duì)頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化分化能力的影響研究

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【摘要】：研究背景:口腔健康與牙齒的健康是社會(huì)文明進(jìn)步的重要標(biāo)志之一,也是提高生命與生活質(zhì)量不可缺少的一部分。然而,我國(guó)的牙齒缺失問(wèn)題相當(dāng)嚴(yán)重,第三次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,全國(guó)65-74歲老年人有牙齒缺失者為86.1%,10%以上的老年人有全口牙缺失,嚴(yán)重影響口腔功能與全身健康;已有數(shù)據(jù)顯示,2005年底,我國(guó)老年人口已達(dá)到1.44億,占全國(guó)總?cè)藬?shù)的11%,到21世紀(jì)中期,老齡人口將達(dá)到30%。社會(huì)的老齡化更加突顯這一問(wèn)題的嚴(yán)重性和解決的迫切性。組織工程化牙齒被認(rèn)為是未來(lái)解決這一問(wèn)題最為理想的手段,也是近年來(lái)口腔醫(yī)學(xué)最為活躍的研究領(lǐng)域之一,特別是干細(xì)胞生物學(xué)的飛速發(fā)展,成就了組織工程化牙齒研究賴以生存的基礎(chǔ)。來(lái)源于顱神經(jīng)嵴的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)是除牙釉質(zhì)以外所有牙齒組織的生成細(xì)胞,被認(rèn)為是上述牙源性干細(xì)胞的始祖細(xì)胞。p75NTR(p75neurotrophin receptor,神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體),被認(rèn)為是神經(jīng)嵴源性干細(xì)胞的特異性表面標(biāo)志物,可用以分選神經(jīng)嵴來(lái)源的外胚間充質(zhì)干細(xì)胞。研究顯示,p75NTR在胚胎發(fā)育過(guò)程中參與多種組織(包括神經(jīng)、脂肪、肝臟、牙齒等)的形態(tài)發(fā)生和發(fā)育。盡管p75NTR在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中的重要作用已得到充分闡述,然而參與調(diào)控神經(jīng)以外組織(如脂肪、肝臟、肌肉、牙齒等)形態(tài)發(fā)生的研究尚處起步階段,特別是其在牙齒發(fā)生、發(fā)育中的潛在調(diào)控作用鮮有報(bào)道。本研究著重在p75NTR對(duì)外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化分化能力的影響,結(jié)合其胞內(nèi)“連接伙伴”Mage-D1,NGF高親和力膜受體Trk A及其配體NGF,闡述p75NTR對(duì)外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化分化能力影響的機(jī)制。為了解牙齒發(fā)生、發(fā)育機(jī)制提供理論依據(jù),為進(jìn)一步發(fā)展牙組織工程化牙齒提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。材料與方法:1.不同胚胎時(shí)期頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞獲得、體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性檢測(cè)SD大鼠胚胎12.5天外胚間充質(zhì)干細(xì)胞組(E12.5d EMSCs);SD大鼠胚胎19.5天外胚間充質(zhì)干細(xì)胞組(E19.5d EMSCs)體外培養(yǎng)與生物學(xué)特性檢測(cè):SD大鼠胚胎12.5天外胚間充質(zhì)干細(xì)胞組(E12.5d EMSCs):選擇SD大鼠從見(jiàn)陰栓午間為胚胎0.5d,第12天午間以40mg/kg注射2%戊巴比妥鈉,行腹腔手術(shù),取出3-5個(gè)胚胎后,分層縫合,待孕鼠蘇醒后標(biāo)記好繼續(xù)飼養(yǎng)。取出的胚胎切取頜突組織,PBS緩沖液沖洗,眼科剪盡量剪碎組織,1%Ⅰ型膠原酶消化,中和離心,去上清后將組織均勻平鋪于6cm培養(yǎng)皿中,加入含100ml/L胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液約4-5ml,置于含5%CO_2的恒溫箱中培養(yǎng),37℃。SD大鼠胚胎19.5天頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞組(E19.5d EMSCs):以E12.5d手術(shù)后孕鼠繼續(xù)飼養(yǎng)胚胎第19.5天,第19.5天午間以40mg/kg注射戊巴比妥鈉,行腹腔手術(shù),取出3-5個(gè)胚胎。取出的胚胎分離上下頜,顯微鏡下用眼科鑷取出牙胚組織,1%Ⅰ型膠原酶消化,中和離心1000r/min,3min,去上清后將組織均勻平鋪于6cm培養(yǎng)皿中,加入含100ml/L胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液約4-5ml,置于含5%CO_2的恒溫箱中培養(yǎng),37℃。分別從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞檢測(cè)表面分子等方面對(duì)兩種EMSCs進(jìn)行檢測(cè)、鑒定。2.P75NTR及相關(guān)礦化基因Runx2在頜突及牙胚中時(shí)空表達(dá)的檢測(cè)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)p75NTR及相關(guān)礦化基因Runx2在大鼠胚胎頜突及牙胚中的時(shí)空表達(dá)。分別于胚胎E12.5d及E19.5d取大鼠胚胎頭部,4%多聚甲醛固定24h,以6um厚度冠狀切片方向作冰凍切片,p75NTR及Runx2相應(yīng)一抗作常規(guī)免疫組化染色。3.對(duì)比不同時(shí)期頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力差別體外礦化誘導(dǎo)E12.5d及E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,對(duì)比兩者礦化能力區(qū)別。利用礦化誘導(dǎo)液(以50 g/L抗壞血酸、10 mmol/Lβ甘油磷酸鈉、10-8M地塞米松及100ml/L胎牛血清配制α-MEM礦化誘導(dǎo)液)每3天換液1次。礦化誘導(dǎo)第7天收集RNA,逆轉(zhuǎn)錄為c DNA后進(jìn)行Real Time-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)趨勢(shì)及ALP染色,誘導(dǎo)第14天進(jìn)行收集蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白趨勢(shì),第28天進(jìn)行茜素紅染色,觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。4.外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化誘導(dǎo)過(guò)程中p75NTR及相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)體外礦化誘導(dǎo)E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,分別在礦化誘導(dǎo)的3天,7天,14天,21天提取細(xì)胞RNA,收集蛋白及細(xì)胞培養(yǎng)基。利用Real Time-PCR,western blot及IP檢測(cè)相關(guān)基因蛋白水平及p75NTR與Mage-D1結(jié)合表達(dá)的變化,ELISA法分析細(xì)胞培養(yǎng)基中NGF在不同誘導(dǎo)時(shí)期的細(xì)胞分泌量變化,免疫共沉淀檢測(cè)p75NTR與Mage-D1在礦化誘導(dǎo)過(guò)程中蛋白之間相結(jié)合的變化趨勢(shì)。5.P75NTR調(diào)控外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力的檢測(cè)利用p75NTR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLJM1-P75包裝入慢病毒,感染E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,上調(diào)p75NTR在目的細(xì)胞中表達(dá);利用p75NTRsiRNA轉(zhuǎn)染E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,下調(diào)p75NTR在目的細(xì)胞中表達(dá),實(shí)驗(yàn)分為4組:p75siRNA(轉(zhuǎn)染p75NTRsiRNA組)、NCon(陰性對(duì)照組)、pLJM1-P75(p75NTR過(guò)表達(dá)質(zhì)粒pLJM1慢病毒感染組)、pLJM1(空載體組)。在礦化誘導(dǎo)第7天提取各組RNA進(jìn)行Real Time-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)變化及ALP染色,礦化誘導(dǎo)第14天收集各組蛋白進(jìn)行Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)變化,礦化誘導(dǎo)第28天進(jìn)行各組茜素紅染色,觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。利用CCK-8試劑盒檢測(cè)pLJM1-P75與pLJM1組外胚間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的變化。6.Mage-D1及NGF對(duì)頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力的影響利用Mage-D1siRNA轉(zhuǎn)染E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,下調(diào)Mage-D1在目的細(xì)胞中的表達(dá);利用100ng/ml NGF作為p75NTR上游配體及激活劑,處理目的細(xì)胞,上調(diào)p75NTR表達(dá),實(shí)驗(yàn)分為3組:NCon(陰性對(duì)照組)、Mage-D1siRNA(轉(zhuǎn)染Mage-D1siRNA組)、NGF(100ng/ml NGF處理組)。在礦化誘導(dǎo)第7天提取各組RNA進(jìn)行Real Time-PCR檢測(cè)相關(guān)基因表達(dá)變化及ALP染色,礦化誘導(dǎo)第14天收集各組蛋白進(jìn)行Western blot劑IP檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)及p75NTR與Mage-D1結(jié)合表達(dá)變化。7.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的制作培養(yǎng)、鑒定及P75NTR基因敲除小鼠Micro CT掃描P75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠,P75NTR雜合子小鼠(p75NTR+/-)及野生型小鼠背景均為129/sv(均源于美國(guó)Jackson實(shí)驗(yàn)室),將p75NTR-/-小鼠、p75NTR+/-小鼠及野生型交配,成功交配生產(chǎn)繁殖后,于出生后第10天剪去小鼠尾巴2mm,做好標(biāo)記,提取DNA,利用QIAGEN Master Mix試劑盒進(jìn)行基因型鑒定。同一天生產(chǎn)的同窩P75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠,P75NTR雜合子小鼠(p75NTR+/-)及野生型小鼠,常規(guī)飼養(yǎng)至60天。隨機(jī)挑選性別,以50mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后,脫頸處死。分離干凈股骨,置入4%多聚甲醛固定組織,于Micro CT(viva ct40 Scanco Medical AG;Brüttisellen,Switzerland)進(jìn)行掃描,后利用其配套軟件進(jìn)行圖形規(guī)劃數(shù)據(jù)分析整理。結(jié)果:1.E12.5d EMSCs和E19.5d EMSCs分別從相應(yīng)時(shí)期胚胎中頜突組織和牙胚組織中獲取,E19.5d EMSCs在顯微鏡下觀察,較E12.5d EMSCs細(xì)胞形態(tài)更顯規(guī)則的紡錘狀成纖維細(xì)胞形態(tài)。E12.5d EMSCs形成克隆集落及數(shù)目大小相較E19.5d EMSCs多及大。利用CCK-8試劑盒檢測(cè)兩者增殖能力的區(qū)別,E12.5d EMSCs增值能力較E19.5d EMSCs為高。流式細(xì)胞儀表面分子檢測(cè)兩種細(xì)胞相應(yīng)表面分子表達(dá),E12.5d EMSCs:CD14(90.4%),CD29(79.5%),CD44(92.8%),CD90(99.03%),CD105(29.3%),CD146(98.1%)和CD166(99.45%);E19.5d EMSCs:CD14(90.46%),CD29(98.93%),CD44(98.26%),CD90(99.64%),CD105(25.97%),CD146(97.39%)和CD166(97.22%)。兩種細(xì)胞都陰性表達(dá)CD45,分別為:3.34%和2.08%。而神經(jīng)嵴源性標(biāo)志性表面分子p75NTR,E19.5d EMSCs的表達(dá)為92.89%,較E12.5d EMSCs表達(dá)23.1%顯著性得增高。2.在牙發(fā)育起始期(E12.5d),p75NTR在增厚的口腔上皮中未見(jiàn)表達(dá),但是在相對(duì)應(yīng)的鄰近間充質(zhì)(濃聚間充質(zhì))中存在弱表達(dá),且能在未來(lái)牙源性上皮間充質(zhì)相互反應(yīng)區(qū)域的間充質(zhì)細(xì)胞中見(jiàn)表達(dá)。在牙發(fā)育鐘狀期(E19.5d),p75NTR在內(nèi)釉上皮,牙囊,牙乳頭接近上皮區(qū)域強(qiáng)表達(dá),這些區(qū)域在牙發(fā)育后期會(huì)出現(xiàn)礦化作用。Runx2表達(dá)與p75NTR表達(dá)存在重疊區(qū)域。3.礦化誘導(dǎo)7天,E19.5d EMSCs的ALP染色深度高于E12.5d EMSCs。礦化誘導(dǎo)28天,茜素紅染色顯示,E19.5d EMSCs礦化結(jié)節(jié)形成的大小及數(shù)目相較于E12.5d EMSCs都為大及多。Real Time-PCR顯示,E19.5d EMSCs p75NTR表達(dá)顯著高于E12.5d EMSCs。對(duì)比兩者礦化能力大小,礦化相關(guān)基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2都與礦化及成牙相關(guān),E19.5d EMSCs表達(dá)都高于E12.5d EMSCs。western blot和Real Time-PCR結(jié)果顯示Mage-D1在兩種細(xì)胞中的表達(dá)未見(jiàn)明顯差異。并且兩者都未見(jiàn)Trk A的表達(dá)。4.礦化誘導(dǎo)過(guò)程中,western blot和Real Time-PCR結(jié)果顯示,E19.5d EMSCs的p75NTR表達(dá)隨礦化誘導(dǎo)天數(shù)增加而不斷增加。礦化相關(guān)基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2與p75NTR趨勢(shì)相同,Trk A未在礦化過(guò)程中存在表達(dá)。雖然Mage-D1表達(dá)在礦化過(guò)程中未見(jiàn)明顯變化,但是免疫共沉淀結(jié)果顯示,Mage-D1與p75NTR的結(jié)合強(qiáng)度隨礦化誘導(dǎo)天數(shù)增加而不斷增加。ELISA結(jié)果顯示自分泌NGF分泌量隨礦化誘導(dǎo)天數(shù)增加而不斷增加,礦化誘導(dǎo)3天時(shí)為31.3±4.4 pg/ml,誘導(dǎo)21天后為378.3±10.9 pg/m。5.pLJM1-p75 EMSCs組p75NTR免疫熒光染色最深,Mage-D1的免疫熒光染色在四個(gè)實(shí)驗(yàn)組中未見(jiàn)明顯差異。利用pLJM1質(zhì)粒過(guò)表達(dá)p75NTR,慢病毒轉(zhuǎn)染入E19.5d EMSCs,礦化相關(guān)基因Runx2、ALP、Osteorix及Col1同源盒基因Dlx5和Msx2表達(dá)隨p75NTR過(guò)表達(dá)而增加。然而,利用P75NTR siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞,E19.5d EMSCs礦化相關(guān)基因也隨著降低。ALP染色在pLJM1-p75 EMSCs組染色最深,而在p75siRNA EMSCs組染色最淺。茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)也顯示,pLJM1-p75 EMSCs組礦化結(jié)節(jié)形成量多及形成較大。形態(tài)學(xué)顯示pLJM1-p75 EMSCs組細(xì)胞的形態(tài)為更為規(guī)則的長(zhǎng)梭形成纖維樣細(xì)胞。但是pLJM1-p75 EMSCs組的細(xì)胞增殖能力較pLJM1 EMSCs組為弱。6.Mage-D1 siRNA組EMSCs ALP染色為最淺。相比較的是100ng/ml NGF組ALP染色為最深。與三組細(xì)胞ALP染色的趨勢(shì)相一致,western blot和Real Time-PCR結(jié)果顯示礦化及成牙相關(guān)基因Runx2,Col1,同源盒基因Dlx5和Msx2表達(dá)量在Mage-D1 siRNA組為低,而在100ng/ml NGF組較高。但是Mage-D1在100ng/ml NGF處理組未見(jiàn)表達(dá)變化。而免疫共沉淀結(jié)果顯示,Mage-D1與p75NTR結(jié)合在100ng/ml NGF處理組較高,而在Mage-D1 siRNA組較低。所有實(shí)驗(yàn)組中的EMSCs都是用的同一代EMSCs以及相同狀態(tài)的EMSCs展開(kāi)研究。7.P75NTR敲除小鼠基因型鑒定結(jié)果,單獨(dú)呈現(xiàn)280bp條帶為p75NTR敲除小鼠純合子型,單獨(dú)呈現(xiàn)345bp條帶為野生型小鼠,而兩條帶都存在于同一泳道為p75NTR雜合型小鼠。Micro CT掃描60天同批次同窩小鼠股骨,三組小鼠(P75NTR基因敲除(p75NTR-/-)小鼠,P75NTR雜合子小鼠(p75NTR+/-)及野生型小鼠)掃描后三維重建數(shù)據(jù)分析結(jié)果:骨小梁骨的分析中TRI-BV(骨量),TRI-BV/TV(骨體積分?jǐn)?shù)),TRI-Tb.N(骨小梁數(shù)),TRI-Tb.Th(骨小梁厚度),p75NTR-/-小鼠較p75NTR+/-及野生型小鼠為低,而TRI-BS/BV(骨表面積/骨量),TRI-Tb.Sp(骨小梁分離度),在p75NTR-/-小鼠中高于其他兩組小鼠,同段股骨的骨皮質(zhì)骨的分析中:骨皮質(zhì)厚度TRI-C.TBTh以及骨皮質(zhì)骨量TRI-C.BVp75NTR-/-小鼠較p75NTR+/-及野生型小鼠為低,但TRI-C.BS/BV在p75NTR-/-小鼠中高于其他兩組小鼠。結(jié)論:1.成功體外培養(yǎng)獲得高純度E12.5d頜突來(lái)源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞及E19.5d牙胚來(lái)源外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,兩種細(xì)胞經(jīng)鑒定都為間充質(zhì)來(lái)源細(xì)胞,且E12.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力高于E19.5d牙胚外胚間充質(zhì)干細(xì)胞。但P75NTR表達(dá)及礦化能力E19.5d牙胚外胚間充質(zhì)干細(xì)胞高于E12.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞,且p75NTR與Runx2在牙發(fā)育各時(shí)期表達(dá)區(qū)域重疊,表明p75NTR在頜突及牙育前期與其礦化發(fā)育相關(guān)。2.p75NTR在外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化過(guò)程中表達(dá)隨礦化時(shí)間不斷增加,表明p75NTR介導(dǎo)外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化過(guò)程。3.在外胚間充質(zhì)干細(xì)胞中過(guò)表達(dá)及干擾p75NTR表達(dá),其礦化能力隨趨勢(shì)而變化,表明P75NTR正向調(diào)控外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力。4.P75NTR通過(guò)結(jié)合Mage-D1,影響礦化及成牙相關(guān)基因與同源盒基因表達(dá),進(jìn)而影響外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力的變化。5.P75NTR基因敲除小鼠,Micro CT掃描結(jié)果表明,p75NTR敲除導(dǎo)致骨發(fā)育不良。綜上所述及本研究結(jié)果表明,P75參與胚胎頜面部及牙發(fā)育,且EMSC礦化作用可能由P75NTR與細(xì)胞內(nèi)Mage D1相結(jié)合,進(jìn)而影響成牙及礦化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因表達(dá)變化,最終影響EMSC礦化能力,初步闡述頜面部發(fā)育期P75NTR參與的EMSC礦化機(jī)制,為頜面部發(fā)育及牙發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞分化機(jī)制,牙發(fā)育組織工程提供理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體 黑色素瘤相關(guān)抗原-D1 外胚間充質(zhì)干細(xì)胞 礦化 神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子 牙發(fā)育 Runx2 DLX5 MSX2
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R781
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-6
• 英文摘要6-15
• 中文摘要15-21
• 前言21-26
• 第一章 E12.5 天及E19.5 天胚胎時(shí)期頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞獲得、體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性檢測(cè)26-37
• 1.1 前言26
• 1.2 材料與方法26-28
• 1.3 實(shí)驗(yàn)方法28-30
• 1.4 結(jié)果30-35
• 1.5 討論35-37
• 第二章 P75NTR在大鼠胚胎 12.5 天及 19.5 天頜面部及牙胚組織中的時(shí)空表達(dá)37-43
• 2.1 前言37
• 2.2 材料與方法37-39
• 2.3 結(jié)果39-41
• 2.4 討論41-43
• 第三章 E12.5d及E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力對(duì)比43-56
• 3.1 前言43-44
• 3.2 材料與方法44-51
• 3.3 結(jié)果51-54
• 3.4 討論54-56
• 第四章 P75NTR介導(dǎo)E19.5d大鼠頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化分化的進(jìn)程56-64
• 4.1 前言56-57
• 4.2 材料與方法57-59
• 4.3 結(jié)果59-63
• 4.4 討論63-64
• 第五章 P75NTR調(diào)控E19.5d頜突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞礦化能力的變化64-78
• 5.1 前言64-65
• 5.2 材料與方法65-71
• 5.3 結(jié)果71-77
• 5.4 討論77-78
• 第六章 Mage-D1及NGF調(diào)控EMSCs礦化能力的變化78-85
• 6.1 前言78-79
• 6.2 材料與方法79-80
• 6.3 結(jié)果80-83
• 6.4 討論83-85
• 第七章 Micro-CT檢測(cè)P75NTR基因敲除小鼠骨發(fā)育情況的研究85-91
• 7.1 前言85
• 7.2 材料與方法85-87
• 7.3 結(jié)果87-89
• 7.4 討論89-91
• 全文總結(jié)91-92
• 參考文獻(xiàn)92-100
• 文獻(xiàn)綜述一 P75NTR作為鑒定多種來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)志物100-114
• 參考文獻(xiàn)106-114
• 文獻(xiàn)綜述二 P75NTR的生物功能和信號(hào)機(jī)制114-164
• 參考文獻(xiàn)138-164
• 博士在讀期間發(fā)表文章及基金獲得164-165
• 致謝165

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本文編號(hào)：945129