本文關(guān)鍵詞：細(xì)胞因子IGFBP5在臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)牙周組織再生中的作用及機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： IGFBP5 成骨分化 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 牙周組織再生

【摘要】：目的:目前間充質(zhì)干細(xì)胞已成為牙周組織再生的種子細(xì)胞,然而其定向分化的分子調(diào)控機(jī)制仍未完全明確,限制了其研究及應(yīng)用。IGFBP5作為胰島素樣生長因子軸的重要組成,在骨組織發(fā)育和再生中有著重要作用,然而其在間充質(zhì)干細(xì)胞及牙周組織再生中的作用尚不清楚。本研究探討IGFBP5在間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化及牙周組織再生中的作用,進(jìn)而可作為潛在的細(xì)胞因子應(yīng)用于組織工程化的牙周組織再生。方法:1.間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取2.構(gòu)建病毒質(zhì)粒通過NCBI數(shù)據(jù)庫查詢IGFBP5的基因序列,設(shè)計(jì)IGFBP5基因全長的PCR引物,用PCR的方法得到IGFBP5的全長并加表面標(biāo)記Flag Tag,將其連接到慢病毒的表達(dá)載體上,測序鑒定,最終構(gòu)建成Flag-IGFBP5的質(zhì)粒。3.病毒包裝及收集慢病毒對照空白質(zhì)粒、Flag-IGFBP5的質(zhì)粒及相應(yīng)的包裝質(zhì)粒(△-F8-74和pMDG)在293T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,48小時后,收集上清,進(jìn)行病毒滴度鑒定,分裝后保存在-80度冰箱。4.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系的建立對照質(zhì)粒及Flag-IGFBP5的病毒轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后一周用流式細(xì)胞儀通過篩選標(biāo)記物GFP得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在mRNA和蛋白水平檢測外源性IGFBP5的表達(dá),得到IGFBP5過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞。5.IGFBP5對干細(xì)胞成骨分化性能影響的體外研究用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液將干細(xì)胞在體外向成骨方向分化誘導(dǎo)。通過測定堿性磷酸酶活性來檢測早期成骨分化指標(biāo)堿性磷酸酶,通過ARS染色及測定鈣離子濃度來檢測晚期成骨指標(biāo)-細(xì)胞礦化能力。并在誘導(dǎo)后3天、7天、10天、2周、3周的不同時間點(diǎn)收獲細(xì)胞,提取mRNA,在RNA水平檢測各個時期成骨分化指標(biāo),來研究IGFBP5對間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的作用。6.臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞再生小型豬牙周組織的體內(nèi)研究建立小型豬牙周炎動物模型:采用制造骨缺損、結(jié)扎絲線及局部涂布牙周致病菌p.g的方法建立小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型,在下頜第一恒磨牙近中鄰面形成3mm×5mm×7mm缺損,然后在缺損處放置絲線,局部涂布牙周致病菌p.g。手術(shù)后6周可成功形成牙周炎骨缺損模型。7只五指山小型豬建立牙周炎模型,共14側(cè),隨機(jī)分為3組:第1組(未治療對照組):在建模后做翻瓣刮治;第2組(vector組):在建模后做翻瓣刮治+vector轉(zhuǎn)染的臍帶干細(xì)胞;第3組(flag-igfbp5組):在建模后做翻瓣刮治+過表達(dá)igfbp5臍帶干細(xì)胞。治療后1個月、3個月通過ct影像學(xué)、geomagicstudio12骨計(jì)量分析、牙周臨床指標(biāo)檢查、elisa和組織病理學(xué)結(jié)果,觀察igfbp5對臍帶干細(xì)胞介導(dǎo)的小型豬牙周炎缺損組織再生修復(fù)能力的影響。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用統(tǒng)計(jì)軟件spss11.5,采用t檢驗(yàn)或者方差分析,p值小于0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.構(gòu)建病毒質(zhì)粒、病毒包裝及收集轉(zhuǎn)染臍帶干細(xì)胞,通過real-timert-pcr和westernblot方法鑒定igfbp5過表達(dá)效果,結(jié)果顯示igfbp5過表達(dá)效果達(dá)80%。2.通過測定4d堿性磷酸酶活性、3wars染色、鈣離子濃度和誘導(dǎo)后1w、2w、3w不同時間點(diǎn)收取的mrna檢測,結(jié)果顯示與對照組相比,過表達(dá)igfbp5的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞alp活性、ars染色、鈣離子濃度顯著增多,成骨/成牙本質(zhì)的分化指標(biāo)osx、on、col1a2、opn、dspp、dmp1的表達(dá)升高。3.通過geomagicstudio12三維計(jì)算新生骨量、ct影像、牙周臨床指標(biāo)檢查、elisa及組織病理學(xué)結(jié)果表明:干細(xì)胞治療12w后,與未治療對照組和vector組相比,flag-igfbp5組牙齦緣無紅腫,位置正常;臨床檢查指標(biāo)pd和al恢復(fù)正常;有大量牙槽骨和新生牙骨質(zhì)生成,新形成的牙周膜纖維附著在牙骨質(zhì)與牙槽骨之間,牙周組織再生良好;齦溝液中炎性因子il8、ifnr、tnfa、il1b的表達(dá)量顯著低。結(jié)論:1.igfbp5可以促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化功能。2.igfbp5可以促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生功能,抑制牙周局部炎癥反應(yīng)。3.IGFBP5可作為候選細(xì)胞因子用于組織工程化的牙周組織再生治療。
【關(guān)鍵詞】：IGFBP5 成骨分化 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞 牙周組織再生
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 縮略語/符號說明12-14
• 前言14-16
• 研究現(xiàn)狀、成果14-15
• 研究目的、方法15-16
• 一、IGFBP5對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外成骨分化功能影響的研究16-32
• 1.1 對象和方法17-25
• 1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料17
• 1.1.2 主要試劑17-18
• 1.1.3 主要設(shè)備18
• 1.1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞的獲取、分離和培養(yǎng)18-19
• 1.1.5 間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇19
• 1.1.6 構(gòu)建病毒質(zhì)粒19-23
• 1.1.7 細(xì)胞培養(yǎng)基上清中IGFBP5的含量23
• 1.1.8 體外成骨/成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化23-25
• 1.1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25
• 1.2 結(jié)果25-29
• 1.2.1 在mRNA和蛋白水平，IGFBP5在PDLSCs和BMSCs、WJCMSCs、ADSCs中的表達(dá)差異25-26
• 1.2.2 通過real-time RT-PCR和Western Blot鑒定，IGFBP5過表達(dá)效果達(dá) 80%26
• 1.2.3 IGFBP5過表達(dá)后導(dǎo)致WJCMSCs骨向分化潛能顯著增強(qiáng)，礦化能力增強(qiáng)26
• 1.2.4 IGFBP5過表達(dá)后促進(jìn)骨粘連蛋白（ON）、Ⅰ型膠原a2鏈（COL1A2）、骨橋蛋白（OPN）、牙本質(zhì)涎磷蛋白（DSPP）、牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷酸化蛋白（DMP1）、OSX蛋白（OSX）表達(dá)上調(diào)26-29
• 1.3 討論29-31
• 1.4 小結(jié)31-32
• 二、IGFBP5對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生影響的研究32-45
• 2.1 對象和方法32-36
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)動物32
• 2.1.2 干細(xì)胞制劑的制備32
• 2.1.3 建立小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損模型32-33
• 2.1.4 間充質(zhì)干細(xì)胞再生修復(fù)小型豬實(shí)驗(yàn)性牙周炎骨缺損33
• 2.1.5 治療后觀察指標(biāo)33-34
• 2.1.6 標(biāo)本固定，脫鈣，脫水處理，，制作石蠟切片34-35
• 2.1.7 石蠟切片HE染色步驟35-36
• 2.1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析36
• 2.2 結(jié)果36-42
• 2.2.1 小型豬牙周炎骨缺損模型的建立36
• 2.2.2 IGFBP5促進(jìn)牙周臨床檢查指標(biāo)PD、AL的改善36-37
• 2.2.3 IGFBP5促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周骨組織再生37
• 2.2.4 IGFBP5促進(jìn)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞介導(dǎo)的牙周組織再生37
• 2.2.5 IGFBP5抑制炎性因子IL8、IFNr、TNFa、IL1b的表達(dá)37-42
• 2.3 討論42-44
• 2.4 小結(jié)44-45
• 結(jié)論45-47
• 參考文獻(xiàn)47-53
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明53-54
• 綜述54-62
• 綜述參考文獻(xiàn)58-62
• 致謝62-63

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