本文關(guān)鍵詞：慢病毒介導過表達hTERT人口腔黏膜上皮穩(wěn)定細胞系的構(gòu)建

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【摘要】：目的:口腔黏膜疾病是發(fā)生于口腔黏膜的所有疾病的總稱,其種類繁多,病因復雜且多數(shù)疾病的致病機理尚未完全明確。其中起源于口腔黏膜的惡性腫瘤不僅發(fā)病率高而且成為影響人們生活質(zhì)量的常見疾病,甚至嚴重威脅著生命健康。由于正常的OMECs體外培養(yǎng)困難,對細胞營養(yǎng)要求高而且存活時間短,一般傳代培養(yǎng)5~6代后即開始衰老死亡,這嚴重限制了我們對其發(fā)病機制的深入研究,因此,迫切需要一個能夠長期穩(wěn)定傳代的OMECs系來作為體外細胞實驗模型。本文研究目的:1.使用慢病毒過表達系統(tǒng)構(gòu)建pLVX-puro-hTERT重組質(zhì)粒并對其進行包裝;2.以包裝成功的慢病毒顆粒感染口腔黏膜上皮細胞(OMECs),建立穩(wěn)定表達外源性人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)基因的口腔黏膜上皮細胞系,為探索建立高效、穩(wěn)定的永生化口腔上皮細胞系提供新的思路。方法:1.通過提取293T細胞總RNA,RT-PCR方法擴增獲得hTERT基因全長,構(gòu)建重組慢病毒載體p LVX-puro-hTERT并使用輔助包裝系統(tǒng)將其包裝為慢病毒顆粒;2.通過使用DisepaeⅡ酶分離,結(jié)合Human Epidermal Keratinocyte Complete Medium Kit無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),體外分離培養(yǎng)獲取原代OMECs,并用包裝好的慢病毒顆粒感染OMECs,通過嘌呤霉素抗性篩選得到陽性克隆,進行傳代培養(yǎng),倒置相差顯微鏡下觀察其生物學性狀;3.采用qRT-PCR和Western blot檢測培養(yǎng)7代后感染細胞中hTERT基因的mRNA及蛋白表達水平。結(jié)果:1.通過RT-PCR獲得目的基因片段hTERT,核酸電泳檢測可見3kb處有一條亮帶,與目的基因大小基本一致。2.重組質(zhì)粒pLVX-puro-hTERT經(jīng)NheI和EcoRI雙酶切鑒定后,可在3.3kb左右處得到一條亮帶,初步表明hTERT已成功插入慢病毒載體pLVX-puro。3.通過對重組質(zhì)粒進行DNA測序,進一步證實重組慢病毒載體pLVX-puro-hTERT構(gòu)建成功。4.顯微鏡下觀察可見成功轉(zhuǎn)染hTERT的OMECs與正常OMECs形態(tài)相似,細胞呈多邊形,“鋪路石”狀緊密排列,具有典型的上皮細胞特征。而轉(zhuǎn)染空載體后的細胞形態(tài)較不規(guī)則,未轉(zhuǎn)染細胞和轉(zhuǎn)染空載體后的細胞傳4-5代后生長緩慢,逐漸衰老死亡,而轉(zhuǎn)染hTERT后的OMECs仍生長迅速并且增殖穩(wěn)定。5.qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后OMECs中hTERT的相對表達,結(jié)果顯示:hTERTmRNA在轉(zhuǎn)染細胞中高表達,與正常OMECs組中hTERTmRNA的表達量呈顯著性差異。表明慢病毒介導的hTERT基因片段已穩(wěn)定整合到OMECs的基因組中并高表達(P0.01)。6.Western blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染細胞組中hTERT蛋白成功表達,與正常細胞組呈顯著差異。這說明hTERT基因已成功整合入口腔黏膜上皮細胞的基因組并可進行翻譯。結(jié)論:本研究通過慢病毒法成功建立了過表達hTERT的OMECs穩(wěn)定細胞系,初步證明了使用慢病毒載體介導hTERT基因永生化OMECs的可能性及優(yōu)越性,為探索構(gòu)建高效、穩(wěn)定增殖的人永生化口腔粘膜上皮細胞細胞系提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：OMECs hTERT 慢病毒載體 穩(wěn)定表達 永生化
【學位授予單位】：蘭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R781.5
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• ABSTRACT5-9
• 縮略詞表9-10
• 第一章 背景研究10-13
• 1.1 口腔黏膜病變的危害10-11
• 1.2 人口腔上皮細胞的體外培養(yǎng)11
• 1.3 永生化的機制11
• 1.4 永生化的方法11-12
• 1.5 本文的研究思路12-13
• 第二章 HTERT-PLVX重組慢病毒載體的構(gòu)建及慢病毒包裝13-27
• 2.1 實驗材料和儀器13-15
• 2.1.1 主要試劑和儀器13-14
• 2.1.2 主要溶液及配置14-15
• 2.2 實驗方法15-21
• 2.2.1 p LVX-puro-hTERT慢載體的構(gòu)建15-20
• 2.2.2 hTERT-p LVX慢病毒包裝20-21
• 2.3 實驗結(jié)果21-26
• 2.3.1 hTERT基因的克隆21
• 2.3.2 hTERT重組質(zhì)粒雙酶切鑒定21-22
• 2.3.3 測序結(jié)果22-25
• 2.3.4 hTERT-p LVX慢病毒包裝25-26
• 2.4 討論26-27
• 第三章 人口腔上皮細胞的培養(yǎng)與鑒定27-32
• 3.1 實驗材料和儀器27-28
• 3.2 實驗方法28-29
• 3.2.1 口腔粘膜上皮細胞的分離和原代培養(yǎng)28
• 3.2.2 口腔粘膜上皮細胞的傳代培養(yǎng)28
• 3.2.3 口腔粘膜上皮細胞的凍存28-29
• 3.3 實驗結(jié)果29-30
• 3.3.1 口腔粘膜上皮細胞的分離培養(yǎng)結(jié)果29-30
• 3.3.2 口腔粘膜上皮細胞的傳代培養(yǎng)30
• 3.4 討論30-32
• 第四章 過表達HTERT人口腔上皮穩(wěn)細胞系的篩選及鑒定32-42
• 4.1 實驗材料和儀器32-34
• 4.1.1 主要材料和試劑32
• 4.1.2 主要溶液及配置32-34
• 4.2 實驗方法34-39
• 4.2.1 過表達hTERT口腔上皮穩(wěn)定細胞系的篩選34
• 4.2.2 qRT-PCR檢測hTERT基因表達34-37
• 4.2.3 Western Blot檢測hTERT蛋白表達37-39
• 4.3 實驗結(jié)果39-41
• 4.3.1 轉(zhuǎn)染后細胞形態(tài)及表型39
• 4.3.2 qRT-PCR檢測hTERT基因表達結(jié)果39-41
• 4.4 討論41-42
• 第五章 結(jié)論與展望42-45
• 5.1 結(jié)論42
• 5.2 展望42-45
• 參考文獻45-49
• 在學期間主要研究成果49-50
• 致謝50

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