本文關(guān)鍵詞：rhBMP4促進(jìn)多潛能的人牙周韌帶干細(xì)胞成腱分化的實驗研究

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【摘要】：研究目標(biāo):干細(xì)胞為基礎(chǔ)的牙周再生是治療牙周疾病引起的組織破壞的一項新穎而有效的治療策略。牙周韌帶干細(xì)胞(human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs)是牙周再生理想的細(xì)胞來源。已知骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(Bone morphogenetic protein-4,BMP4)具有維持牙周干細(xì)胞干性和多向分化潛能的潛能。然而,骨形態(tài)發(fā)生蛋白4在誘導(dǎo)牙周干細(xì)胞向肌腱/韌帶方向分化上的功能猶未可知。研究方法:1.本研究采用酶消化法體外培養(yǎng)h PDLSCs。細(xì)胞的干性檢測:反轉(zhuǎn)錄PCR檢測干性指標(biāo)CD-146、c-Myc、Nanog和Oct-4A,流式細(xì)胞術(shù)鑒定牙周韌帶干細(xì)胞標(biāo)志物STRO-1和CD146的比例。細(xì)胞分化能力檢測:茜素紅染色鑒定成骨分化能力,反轉(zhuǎn)錄PCR檢測分析細(xì)胞韌帶/肌腱標(biāo)記物SCX、Six1、Six2和TNC。2.在體外培養(yǎng)的h PDLSCs中添加rh BMP4蛋白、BMP4過表達(dá)質(zhì)粒或rh Noggin蛋白,接著Real-time PCR檢測過表達(dá)或抑制BMP4信號通路對h PDLSCs成骨分化轉(zhuǎn)錄因子Runx2以及肌腱發(fā)育的標(biāo)志基因Tenascin C(TNC)、Collagen 1α1(COL1α1)和Collagen 1α2(COL1α2)轉(zhuǎn)錄水平的變化,Western Blot檢測其Runx2和TNC的變化。3.隨后通過對肌腱特異性轉(zhuǎn)錄因子Scleraxis(SCX)mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平以及細(xì)胞免疫熒光對表達(dá)位置的分析,結(jié)合搜索STRING數(shù)據(jù)庫中BMP4與SCX的關(guān)系,同時利用VISTA軟件分析SCX啟動子上是否有Smad的結(jié)合位點。研究結(jié)果:1.h PDLSCs細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記基因、腱性標(biāo)記物以及具有骨向分化潛能:第三代h PDLSCs中CD146和STRO-1陽性表達(dá)百分比分別為65.26%和7.14%。內(nèi)源性干性基因RT-PCR顯示c-MYC和OCT-4A表達(dá)量與CD146接近,Nanog熒光較低。h PDLSCs經(jīng)過三周成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)和茜素紅染色可見明顯的鈣化結(jié)節(jié)。內(nèi)源性成腱基因的RT-PCR顯示其較高表達(dá)SCX和Six2,而Six1和TNC表達(dá)較弱。2.rh BMP4增加h PDLSCs中Runx2 m RNA和蛋白的表達(dá):rh BMP4(10ng/ml,100ng/ml)對Runx2 m RNA表達(dá)的促進(jìn)呈時間依賴關(guān)系,處理后第一天開始出現(xiàn),第三天變化明顯,而第七天未見明顯差異。rh Noggin(BMP4的拮抗劑)(1拮抗劑gg)處理后的第一天對Runx2的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響,在第三天降低了表達(dá)水平。更進(jìn)一步地,蛋白質(zhì)定量分析實驗同樣證明了rh BMP4(10ng/ml)處理1天后促進(jìn)h PDLSCs細(xì)胞核內(nèi)Runx2蛋白水平的表達(dá)。3.BMP4促進(jìn)h PDSCs中TNC的表達(dá)并依賴于細(xì)胞外基質(zhì)濃度:rh BMP4(10ng/ml,100 ng/ml)處理之后的第一天,TNC m RNA的表達(dá)水平明顯增加。同樣地,利用lipofectamine 2000包裹BMP4過表達(dá)質(zhì)粒p NL-BMP4-IRES2-EGFP轉(zhuǎn)染h PDLSCs一天后,也在蛋白質(zhì)水平上增加TNC的表達(dá)。Westernblot的分析結(jié)果表明,高濃度的CollagenⅤ促進(jìn)h PDLSC中TNC蛋白的表達(dá)水平,BMP4在高濃度的CollagenⅤ(3mg/ml)環(huán)境下對TNC的表達(dá)水平有明顯促進(jìn)作用。BMP4在低濃度的CollagenⅤ(1.25mg/ml)環(huán)境下,對TNC蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有促進(jìn)作用。4.BMP4維持h PDLSCs細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白基因的表達(dá):反轉(zhuǎn)錄PCR的結(jié)果顯示,在BMP4和Noggin處理后的第一天,Col Iα1和Col Iα2兩個基因的表達(dá)水平都沒有明顯變化。但是在處理之后第三天,對照組,高濃度BMP4組(100 ng/ml)和Noggin組(1 ng/ml),Col Iα1和Col Iα2的表達(dá)水平都降低,只有低濃度BMP4(10 ng/ml)組還維持著可見的Col Iα1和Col Iα2維持著基因表達(dá).5.BMP4增加h PDLSCs中SCX m RNA和蛋白的表達(dá):BMP4蛋白對SCX的促進(jìn)成時間依賴關(guān)系,在處理之后第一天開始出現(xiàn),處理之后第三天變化明顯,處理之后第七天變化不明顯。Noggin(1ug/ml)處理之后的第一天對SCX的表達(dá)水平?jīng)]有明顯影響,在處理之后的第三天降低SCX的表達(dá)水平。更進(jìn)一步地,蛋白質(zhì)的定量分析實驗同樣證明了BMP4蛋白促進(jìn)h PDLSCs細(xì)胞核內(nèi)SCX蛋白的表達(dá)。6.BMP4蛋白誘導(dǎo)SCX的核向定位:低濃度BMP4(10 ng/ml)處理之后6小時的h PDLSC中,SCX在細(xì)胞核內(nèi)的定位顯著增加,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的定位減少。量化結(jié)果顯示,對照組中核內(nèi)SCX蛋白占總量的43%,BMP4使SCX的核內(nèi)定位提高到72%。7.STRING數(shù)據(jù)庫和VISTA軟件分析表明SCX轉(zhuǎn)錄起始位點上游存在有Smad和Smad3的結(jié)合位點。研究結(jié)論:rh BMP4能瞬時地誘導(dǎo)SCX的核內(nèi)定位,增加肌腱相關(guān)基因和/或蛋白SCX,Tenascin C,Collagen 1α1和Collagen1α2的表達(dá),初步揭示BMP4促進(jìn)h PDLSCs成腱分化的可能機制。
【關(guān)鍵詞】：BMP4 SCX 核定位 hPDLSCs 成腱分化
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R781.4
【目錄】：

• 中英文縮略詞表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-14
• 第一部分 hPDLSCs的干性和多向分化潛能鑒定14-28
• 材料和方法14-21
• 一、主要材料試劑和儀器14-15
• 二、實驗方法15-21
• 結(jié)果21-26
• 1. hPDLSCs細(xì)胞的分離培養(yǎng)21
• 2. hPDLSCs細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記基因21-23
• 3. hPDLSCs細(xì)胞具有骨向分化潛能23-24
• 4. hPDLSCs細(xì)胞表達(dá)韌帶標(biāo)記物24-26
• 討論26-28
• 第二部分 rhBMP4對hPDLSCs分化潛能的影響28-41
• 材料和方法28-35
• 一、主要材料試劑和儀器28-30
• 二、實驗方法30-35
• 結(jié)果35-39
• 1. BMP4增加h PDLSCs中Runx2 m RNA和蛋白的表達(dá)35-36
• 2. BMP4蛋白誘導(dǎo)hPDLSCs的肌腱／韌帶方向分化受膠原蛋白影響36-39
• 討論39-41
• 第三部分 rhBMP4促進(jìn)hPDLSCs成腱的機制研究41-48
• 材料和方法41-43
• 一、主要材料試劑和儀器41
• 二、實驗方法41-43
• 結(jié)果43-47
• 1. rhBMP4增加hPDLSCs中SCX mRNA和蛋白的表達(dá)43-45
• 2. rhBMP4蛋白誘導(dǎo)SCX的核向定位45-46
• 3. rhBMP4蛋白促進(jìn)SCX表達(dá)的可能機制46-47
• 討論47-48
• 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-55
• 綜述55-73
• References68-73
• 致謝73-74

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：869994